吞噬作用检测：一种免疫染色技术，用于可视化观察黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎细胞中凋亡细胞的吞噬过程

摘要

来源：Nonaka, S. 等. 凋亡细胞吞噬实验 黑腹果蝇 胚胎。 视频实验杂志 (2017).

本视频展示了一种免疫染色技术，用于观察黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎匀浆细胞中的凋亡细胞吞噬现象。该方法通过测定凋亡细胞被吞噬的程度，揭示细胞生理学的相关机制。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 血细胞染色

1. 使用抗Croquemort抗体进行免疫染色
   1. 依次将玻片浸入甲醇中10分钟，浸入含0.2%（v/v）Triton X-100的PBS中10分钟，再浸入PBS中10分钟。
   2. 在细胞上加入20 µL含0.2% (v/v) Triton X-100的PBS缓冲液配制的5% (v/v) 全猪血清进行封闭。室温孵育载玻片20分钟。
   3. 从玻片上移除溶液，加入20 µL含0.2% (v/v) Triton X-100的PBS配制的抗Croquemort抗血清（0.1% (v/v)），覆盖细胞。4 °C孵育过夜。
   4. 将玻璃载玻片浸入含0.2% (v/v) Triton X-100的PBS中，每次10分钟，共5次。
   5. 将载玻片浸入 PBS 中孵育 10 分钟。
   6. 在室温下，将20 µL碱性磷酸酶标记的抗大鼠IgG（0.5% (v/v)）溶于含0.2% (v/v) Triton X-100和5% (v/v) 全猪血清的PBS中，孵育细胞1 h。
   7. 将玻璃载玻片在含有0.2% (v/v) Triton X-100的PBS中浸泡，每次10分钟，重复5次。
   8. 将载玻片浸泡于含有 100 mM Tris-HCl（pH 9.5）、100 mM NaCl 和 50 mM MgCl2 的缓冲液中 10 分钟。
   9. 加入含有0.23 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）、0.35 mg/mL硝基蓝四氮唑（NBT）、100 mM Tris-HCl（pH 9.5）、100 mM NaCl和50 mM MgCl₂的磷酸酶底物溶液₂ 在细胞上。
   10. 在显微镜下观察细胞以判断染色效果。当血细胞颗粒中出现明显的紫色信号时，移除底物溶液，并将玻片浸入含有10 mM Tris-HCl（pH 8.5）和1 mM EDTA的缓冲液中。建议染色时间为5–10分钟。

2. 通过TUNEL染色凋亡细胞

1. 将载玻片在 PBS 中浸泡 5 分钟。
2. 更换新的 PBS，重复此步骤。
3. 在细胞上加入平衡缓冲液（见材料表），孵育 10 分钟。
4. 移除载玻片上的溶液，并在细胞上加入 20 µL TdT 溶液（包含 5 µL 末端脱氧核苷酸转移酶和 15 µL 反应缓冲液），于 37 °C 孵育 1 小时。
5. 移除载玻片上的溶液，并将载玻片浸泡于由 0.5 mL 终止/洗涤缓冲液与 17 mL 水组成的缓冲液中。
6. 将载玻片在 PBS 中浸泡 5 分钟，重复 3 次。
7. 在细胞上加入 20 µL 抗地高辛-过氧化物酶溶液，室温孵育 30 分钟。
8. 将载玻片在 PBS 中浸泡 5 分钟，重复 4 次。
9. 将载玻片浸泡于过氧化物酶底物溶液中，该溶液由 30 mL 含有足量 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）微 spatula 的 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）和 0.002%（v/v）H₂O₂ 组成，孵育 30 秒。
10. 重复上一步骤，直至凋亡细胞呈现棕褐色染色。将载玻片浸泡于水中以终止过氧化物酶反应。
11. 加水封片以便观察。

3. 检测凋亡细胞的吞噬水平

1. 在光学显微镜下观察样本，以评估吞噬作用水平。将 Croquemort 阳性细胞或 GFP 阳性细胞计数为血细胞，TUNEL 阳性细胞计数为凋亡细胞，双阳性细胞计数为正在吞噬的血细胞。
2. 吞噬指数定义为双阳性细胞数占 Croquemort 阳性细胞总数或 GFP 阳性细胞总数的比例。建议观察超过 300 个血细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全猪血清	MP Biomedicals	55993	用于封闭
Kpl 抗大鼠 IgG (H+L) 抗体 MSA，碱性磷酸酶标记	KPL	475-1612	用于抗 Croquemort 抗体染色血细胞的二抗
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐	Roche	11383221001	BCIP，用于血细胞染色
硝基蓝四氮唑	Roche	11383213001	NBT，用于血细胞染色
抗 Croquemort 抗体			见 Manaka 等，J. Biol. Chem.，279，48466-48476 中先前描述
Apop Tag 过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒	Millipore	S7100	用于凋亡细胞染色。该试剂盒包含平衡缓冲液、反应缓冲液、终止/洗涤缓冲液、TdT 酶和抗地高辛过氧化物酶。
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐	nacalai tesque	11009-41	DAB，用于凋亡细胞染色