吞噬作用检测：一种免疫染色技术，用于可视化观察黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎细胞中凋亡细胞的吞噬过程

摘要

来源：Nonaka, S. 等. 凋亡细胞吞噬实验 黑腹果蝇 胚胎。 视频实验杂志 (2017).

本视频展示了一种免疫染色技术，用于观察黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎匀浆细胞中的凋亡细胞吞噬现象。该方法通过测定凋亡细胞被吞噬的程度，揭示细胞生理学的相关机制。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 血细胞染色

1. 使用抗Croquemort抗体进行免疫染色
   1. 依次将玻片浸入甲醇中10分钟，浸入含0.2%（v/v）Triton X-100的PBS中10分钟，再浸入PBS中10分钟。
   2. 在细胞上加入20 µL含0.2% (v/v) Triton X-100的PBS缓冲液配制的5% (v/v) 全猪血清进行封闭。室温孵育载玻片20分钟。
   3. 从玻片上移除溶液，加入20 µL含0.2% (v/v) Triton X-100的PBS配制的抗Croquemort抗血清（0.1% (v/v)），覆盖细胞。4 °C孵育过夜。
   4. 将玻璃载玻片浸入含0.2% (v/v) Triton X-100的PBS中，每次10分钟，共5次。
   5. 将载玻片浸入 PBS 中孵育 10 分钟。
   6. 在室温下，将20 µL碱性磷酸酶标记的抗大鼠IgG（0.5% (v/v)）溶于含0.2% (v/v) Triton X-100和5% (v/v) 全猪血清的PBS中，孵育细胞1 h。
   7. 将玻璃载玻片在含有0.2% (v/v) Triton X-100的PBS中浸泡，每次10分钟，重复5次。
   8. 将载玻片浸泡于含有 100 mM Tris-HCl（p....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全猪血清	MP Biomedicals	55993	用于封闭
Kpl 抗大鼠 IgG (H+L) 抗体 MSA，碱性磷酸酶标记	KPL	475-1612	用于抗 Croquemort 抗体染色血细胞的二抗
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐	Roche	11383221001	BCIP，用于血细胞染色
硝基蓝四氮唑	Roche	11383213001	NBT，用于血细胞染色
抗 Croquemort 抗体			见 Manaka 等，J. Biol. Chem.，279，48466-48476 中先前描述
Apop Tag 过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒	Millipore	S7100	用于凋亡细胞染色。该试剂盒包含平衡缓冲液、反应缓冲液、终止/洗涤缓冲液、TdT 酶和抗地高辛过氧化物酶。
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐	nacalai tesque	11009-41	DAB，用于凋亡细胞染色