固定细胞吞噬凋亡细胞实验：一种利用荧光显微镜研究巨噬细胞对凋亡细胞吞噬作用的方法

摘要

来源：Taruc, K.，等。通过单细胞荧光显微镜定量胞葬作用。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们演示了利用共聚焦显微镜研究凋亡细胞清除过程的胞葬作用检测方法。胞葬作用是一个多步骤过程，其中凋亡细胞被吞噬细胞吞噬，并在称为胞葬体的囊泡内降解。本方案提供了一种可视化单个凋亡细胞被内化与未内化部分的方法，并可对胞葬作用进行定量分析。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. THP-1 单核细胞系的培养与准备

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，将THP-1单核细胞以悬浮培养方式培养于T25培养瓶中₂细胞应在5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) 培养基加10%胎牛血清（FBS）中培养。
2. 每天轻轻摇晃培养瓶，使细胞在培养基中均匀悬浮，随后立即用血细胞计数板进行细胞计数。当细胞密度达到 1 x 10⁶ cells/mL:
   1. 将 RPMI 1640 + 10% FBS 预热至 37 °C 水浴中。
   2. 转移 2 x 10⁵ 将细胞转入1.5 mL微量离心管或15 mL锥形管中，于500 x g离心以形成细胞沉淀 g 室温下孵育5分钟。
   3. 移去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后用1 mL（1.5 mL 微离心管）或5 mL（15 mL 锥形管）磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀。
   4. 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。小心移除 PBS，避免扰动细胞沉淀。
   5. 将沉淀重悬于1 mL新鲜的RPMI 1640 + 10% FBS中。
   6. 将....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 培养基	Wisent	3500-000-EL
DMEM 培养基	Wisent	319-005-CL
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm 圆形玻璃盖玻片，#1.5 厚度	Electron Microscopy Sciences	72290-08	盖玻片的尺寸和形状并非关键，但 18 mm 可适配标准 12 孔板的孔，便于细胞培养
星形孢菌素（Staurosporine）	Cayman Chemical	81590	用 DMSO 溶解至 1 mM（1,000 倍储存液）
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	储存于干燥器中。请勿配制储存液。
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly 细胞分离介质	Cedarlane Labs	CL5071
重组人 M-CSF	Peprotech	200-04
重组人 IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 巨噬细胞系	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 人单核细胞系	ATCC	TIB-202
Jurkat T 细胞系	ATCC	TIB-152