固定细胞吞噬凋亡细胞实验：一种利用荧光显微镜研究巨噬细胞对凋亡细胞吞噬作用的方法

摘要

来源：Taruc, K.，等。通过单细胞荧光显微镜定量胞葬作用。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们演示了利用共聚焦显微镜研究凋亡细胞清除过程的胞葬作用检测方法。胞葬作用是一个多步骤过程，其中凋亡细胞被吞噬细胞吞噬，并在称为胞葬体的囊泡内降解。本方案提供了一种可视化单个凋亡细胞被内化与未内化部分的方法，并可对胞葬作用进行定量分析。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. THP-1 单核细胞系的培养与准备

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，将THP-1单核细胞以悬浮培养方式培养于T25培养瓶中₂细胞应在5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) 培养基加10%胎牛血清（FBS）中培养。
2. 每天轻轻摇晃培养瓶，使细胞在培养基中均匀悬浮，随后立即用血细胞计数板进行细胞计数。当细胞密度达到 1 x 10⁶ cells/mL:
   1. 将 RPMI 1640 + 10% FBS 预热至 37 °C 水浴中。
   2. 转移 2 x 10⁵ 将细胞转入1.5 mL微量离心管或15 mL锥形管中，于500 x g离心以形成细胞沉淀 g 室温下孵育5分钟。
   3. 移去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后用1 mL（1.5 mL 微离心管）或5 mL（15 mL 锥形管）磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀。
   4. 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。小心移除 PBS，避免扰动细胞沉淀。
   5. 将沉淀重悬于1 mL新鲜的RPMI 1640 + 10% FBS中。
   6. 将4 mL预热的培养基加入一个新的T25培养瓶中，然后加入1.2.5步骤中重悬的细胞。在37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 孵育至细胞需要传代（通常为3天）或实验所需时。
3. 对于使用THP-1来源的巨噬细胞的实验，应在传代前从培养瓶中取出所需数量的细胞并进行铺板：
   1. 将所需数量的18 mm圆形玻璃盖玻片（#1.5厚度）放入12孔板的各孔中——通常每种条件和/或时间点对应1个盖玻片。向每孔加入5 × 10⁴ THP-1 单核细胞。可根据需要调整每孔加入的细胞数量。
   2. 使用预热至 37 °C 的 RPMI + 10% FBS 将每孔含细胞的培养液体积补至 1 mL。
   3. 每孔加入100 nM佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA），培养3天，以诱导THP-1单核细胞向类巨噬细胞分化。

2. J774.2 巨噬细胞系的培养与制备

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，将J774.2细胞接种于T25培养瓶中培养。细胞培养使用5 mL的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）+ 10%胎牛血清（FBS），当细胞融合度达到80–90%时进行传代。传代操作步骤如下：
   1. 吸除培养瓶中的全部培养基，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次。
   2. 吸除PBS，加入5 mL新鲜DMEM + 10% FBS培养基。
   3. 使用细胞刮轻轻刮取培养瓶底部，使细胞悬浮于培养基中，随后剧烈吹打数次以充分分散细胞团块。
   4. 将细胞按1:5比例稀释：从培养瓶中移除4 mL细胞悬液，补充4 mL新鲜培养基。剩余的细胞悬液可弃去，或用于接种新的T25培养瓶建立新培养，或直接用于实验。
2. 准备J774.2细胞的胞葬作用（efferocytosis）实验：
   1. 实验开始前一天，按照步骤1.1.1–1.1.3的方法将J774.2细胞重悬于5 mL新鲜培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并配制所需体积的细胞悬液，浓度为5 × 10⁴ 个细胞/mL。
   2. 将所需数量的18 mm圆形玻璃盖玻片（#1.5厚度）放入12孔板的各孔中，每孔加入1 mL浓度为5 × 10⁴ 个细胞/mL的细胞悬液。
   3. 过夜培养，使细胞充分贴附于盖玻片并从传代操作中恢复。

3. 原代人M2型巨噬细胞的培养

1. 每需要一块24孔板的M2型巨噬细胞，采集10 mL肝素抗凝的人全血。
2. 在15 mL离心管中，将5 mL人血叠加于5 mL预热的Lympholyte-poly细胞分离介质上方。若需处理多个样本，请准备多个离心管 >5 mL 血液，而不是使用更大体积的试管。
3. 以中等加速度离心，300 × g 离心 35 分钟，不使用刹车。
4. 小心吸取富含单个核细胞的上层条带，使用塑料移液器转移至一个50 mL离心管中。如果在步骤3.2中制备了多个离心管，可将各管中的条带合并至同一个50 mL离心管中。用PBS将管内液体体积补至50 mL。
5. 以 300 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。在此步骤中，将已灭菌的直径为 18 mm 的圆形盖玻片（#1.5 厚度）放入 12 孔板的每个孔中。
6. 将细胞沉淀重悬于每孔所需的300 µL无血清RPMI 1640培养基中； 例如， 如果处理10 mL血液以制备完整的12孔板，则将细胞沉淀重悬于3.6 mL培养基中。
7. 向12孔板中每个含盖玻片的孔加入300 µL细胞悬液。在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。₂.
8. 用1 mL预热的PBS轻柔洗涤盖玻片3次，以去除未贴壁的细胞。
9. 加入1 mL RPMI 1640培养基，含10% FBS、10 ng/mL重组人M-CSF及细胞培养用抗生素/抗真菌剂。37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 5天。
10. 更换培养基为RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL 重组人M-CSF + 10 ng/mL 重组人IL-4 + 细胞培养用抗生素/抗真菌剂。于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 培养2天以完成M2极化。
11. 极化巨噬细胞应在接下来的3天内使用。

4. 凋亡Jurkat细胞的制备

1. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下，将 Jurkat 细胞培养于 5 mL RPMI 1640 培养基（含 10% FBS）中。Jurkat 细胞为悬浮细胞系，可通过每 3–5 天以 1:5 比例传代至新鲜预温培养基中进行维持。
2. 为制备凋亡细胞，使 Jurkat 细胞培养物生长至高密度（传代后 4–5 天）。取 1.5 mL 培养物转移至 1.5 mL 微量离心管中，于 500 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 含 1 µM 星形孢菌素（staurosporine）的无血清 RPMI 1640 培养基中。
4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16 小时，以诱导细胞发生凋亡。
5. 如需验证凋亡诱导效果，可使用 Annexin V 染色进行检测：
   1. 取 100 µL 经星形孢菌素处理的 Jurkat 细胞培养物至 1.5 mL 微量离心管中，于 500 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 无血清 RPMI 1640 培养基中。
   2. 加入 1 µL 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Annexin V，室温避光孵育 10 分钟。
   3. 加入 900 µL PBS，将全部液体转移至 12 孔板中一个含有 18 mm 圆形玻璃盖玻片（#1.5 厚度）的孔内。使用配备板架的离心机以 200 × g 离心 1 分钟，使细胞贴附于盖玻片表面。或者，也可将细胞置于带孔载玻片中用于成像。
   4. 使用荧光显微镜进行成像观察。

5. 使用固定细胞胞葬作用检测和由内向外染色法量化胞葬摄取与动态过程

1. 按照所述方法准备 THP-1、J774.2 或 M2 人巨噬细胞 第1-3节， 分别。
2. 实验开始前一晚，按如下所述制备凋亡的Jurkat细胞 第4节.
3. 实验前立即使用血细胞计数板计数凋亡细胞。将足够数量的凋亡细胞转移至1.5 mL微量离心管中——我们通常加入5 × 10⁵ 细胞/孔，使靶细胞：效应细胞比例为10:1。
4. 以500 × g离心5分钟沉淀Jurkat细胞，然后在500 μL PBS中重悬。
5. 离心期间，将10 µL DMSO分装至新的1.5 mL微量离心管中。加入极少量N-羟基琥珀酰亚胺生物素（NHS-Biotin）溶于DMSO中，5–10个晶体（约0.005 mg）即可。
6. 将500 μL凋亡细胞/PBS悬液转移至含有DMSO/NHS-生物素的离心管中。随后，将细胞示踪染料稀释至制造商推荐的浓度，并加入凋亡细胞悬液中。务必选择一种在光谱上不与FITC-链霉亲和素重叠的细胞示踪染料例如 红色或远红细胞示踪染料
7. 室温避光孵育悬液20分钟。加入等体积的RPMI 1640 + 10% FBS，室温避光孵育5分钟，以淬灭未反应的染料。
8. 500 × g 离心收集细胞 g 孵育5分钟，弃去上清液，每孔巨噬细胞中加入100 µL RPMI 1640 + 10% FBS重悬经染色的凋亡细胞。
9. 将100 µL染色的凋亡细胞悬液逐滴加入每孔巨噬细胞中。使用配备板架的离心机，以200 × g离心1分钟，使巨噬细胞与凋亡细胞充分接触。
10. 在37 °C、5% CO₂条件下将培养板孵育所需时间₂ 在组织培养孵箱中进行。对于巨噬细胞，胞葬作用所摄取的物质通常在20–30分钟后首次可检测到，120–180分钟后完成。
11. 在预定时间点将细胞从培养箱中取出。用1 mL室温的PBS洗涤细胞两次，以终止胞葬作用并去除未被胞葬的凋亡细胞。
12. 每孔加入1:1,000稀释的FITC标记链霉亲和素，避光孵育20分钟。此步骤将标记所有未被胞葬作用清除的凋亡细胞物质上暴露的生物素。
    注意： 如需在此步骤中对细胞核进行染色，可加入1:20,000稀释的Hoechst 33342或4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）。
13. 用1 mL PBS洗涤细胞3次，每次轻轻振荡或摇动样本5分钟。用PBS配制的4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞20分钟。用PBS冲洗细胞一次，以去除多余的PFA。
14. 将盖玻片固定在载玻片上用于成像，并转移至荧光显微镜。采集足够数量细胞的z轴层扫图像，以实现准确的定量分析——通常每种条件下10–30个细胞。在所得图像中，未被内化的凋亡细胞物质表现为被FITC-链霉亲和素染色包裹的细胞示踪染料标记物质，而被胞葬作用吞噬的物质则呈现为独立的、无任何链霉亲和素染色的细胞示踪染料点状信号。
15. 通过多种指标对所得图像中的胞葬作用进行定量分析：
    1. 通过测定每个巨噬细胞中平均的独立吞噬小体数量（细胞示踪染料阳性/链霉亲和素点状信号）来计算胞葬指数。仅对与凋亡细胞结合或含有≥1个可见吞噬小体的巨噬细胞进行定量。将与凋亡细胞结合但无独立吞噬小体的巨噬细胞记录为胞葬指数为0。
    2. 通过测量含有≥1个胞葬小体的巨噬细胞比例来计算胞葬效率。
    3. 通过在多个时间点对固定并染色的细胞进行成像，计算胞葬作用速率。仅对结合了凋亡细胞或含有可见胞葬小体的巨噬细胞进行成像，并采集每个细胞的z轴层扫图像。成像完成后，确定胞葬作用速率：
       1. 以链霉亲和素染色作为引导，使用 FIJI/ImageJ（或其他图像分析软件包）中的徒手或套索选择工具，圈出所有细胞示踪染料阳性/链霉亲和素阴性（cell tracking dye+/streptavidin-）的细胞例如 在z轴堆栈的单一层面上测量被内化的物质。测量该区域内细胞示踪染料的总荧光强度。每个效应小体的单独测量值（例如 直径，相对于细胞边界或细胞核的位置 等等。可轻松与这些测量同时获取，从而显著增加分析过程中收集的数据量。
       2. 在同一z轴层面，以链霉亲和素染色为参考，使用自由手绘或套索多边形选择工具，圈选出所有细胞示踪染料阳性/链霉亲和素阳性（cell tracking dye+/streptavidin+）的区域。例如 单层z轴堆栈图像中未被内吞的物质。仅包含与吞噬细胞接触的凋亡细胞的染色信号。测量该区域的总荧光强度。
       3. 重复步骤 4.2.3.1 至 4.2.3.2，处理图像中剩余的 z 层切片。对已吞噬凋亡细胞的（Σ_eff）以及未被胞葬的（Σ_ne）材料。可据此计算细胞中被胞葬作用清除的凋亡细胞比例：
          
       4. 量化所有时间点下所有细胞的被吞噬比例。需要注意的是，由于不同凋亡细胞对细胞示踪染料的摄取存在差异，以及图像采集参数（如曝光时间）的变化，凋亡细胞/胞葬小体的荧光强度在不同图像之间可能存在差异。因此，在不同图像、不同实验条件以及重复实验之间进行比较时，仅可比较标准化后的数值（如被吞噬比例），或与荧光强度无关的数值（如胞葬指数和胞葬效率）。
    4. 为确保所得数据集准确反映细胞间胞葬作用的差异，应在每次实验中尽可能对最多数量的细胞进行这些分析。
       注意： 吞噬效率和吞噬指数可快速计算（每细胞数秒），我们通常每项实验至少分析100个细胞，并至少重复实验3次。计算被吞噬物质的比例及吞噬体特异性参数较为耗时，经验丰富的分析人员通常需要每细胞2–3分钟。针对这些计算，我们每实验条件每项实验至少定量15个细胞。
    5. 记录每个细胞的胞葬指数、被胞葬比例及单个胞葬体数据。
       注意： 这使得可以采用单细胞方法进行数据分析，从而量化细胞间的差异。通过对单次实验中获得的单细胞数据进行平均，仍可在群体水平上对这些数据集进行分析。效应小体特异性测量可在群体水平、单细胞水平以及集合水平上进行分析。例如 作为独立于含细胞的吞噬体群体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 培养基	Wisent	3500-000-EL
DMEM 培养基	Wisent	319-005-CL
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm 圆形玻璃盖玻片，#1.5 厚度	Electron Microscopy Sciences	72290-08	盖玻片的尺寸和形状并非关键，但 18 mm 可适配标准 12 孔板的孔，便于细胞培养
星形孢菌素（Staurosporine）	Cayman Chemical	81590	用 DMSO 溶解至 1 mM（1,000 倍储存液）
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	储存于干燥器中。请勿配制储存液。
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly 细胞分离介质	Cedarlane Labs	CL5071
重组人 M-CSF	Peprotech	200-04
重组人 IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 巨噬细胞系	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 人单核细胞系	ATCC	TIB-202
Jurkat T 细胞系	ATCC	TIB-152