体外单卵母细胞报告基因检测：一种研究体外卵母细胞成熟过程中靶mRNA翻译调控的技术

摘要

来源：Costermans, N. G. J. 等，利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序。J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们证明在存在磷酸二酯酶抑制剂的情况下，卵母细胞的细胞周期会停滞在第一次减数分裂前期，此时转录的 mRNA 在无翻译的情况下被储存。当抑制剂被去除后，卵母细胞的成熟过程恢复，细胞进入第一次减数分裂中期。在第一次减数分裂中期，与目标基因融合的报告 mRNA 信号表明翻译机制被激活，蛋白质开始表达。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 培养基的制备

1. 按照表1所述，加入所有组分以配制基础卵母细胞采集液和卵母细胞成熟液。对于基础采集液，将pH值调至7.4。在使用当天，向采集液和成熟液中均添加3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和1 µM西洛他唑（cilostamide）。

2. Ypet-3'非翻译区和mCherry编码mRNA的制备

1. 获取目的mRNA的3′非翻译区序列。
   注意： 本研究中所用序列先前从鼠卵母细胞cDNA中获得。
2. 设计引物以从卵母细胞cDNA中扩增目标3'非翻译区，以及pcDNA 3.1载体中含有Ypet编码序列、V5-表位标签和T7启动子的部分。
3. 使用高保真DNA聚合酶试剂盒进行扩增。将聚合酶链式反应（PCR）产物在琼脂糖凝胶上电泳，检测片段大小是否正确，切下目标条带，并根据试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒从凝胶中提取DNA。
4. 使用PCR克隆试剂盒将PCR片段连接至载体。
   注意： PCR片段在冰上孵育4小时，以促进更高效的重组反应。这与制造商推荐的45分钟孵育时间相反。
5. 将PCR片段转染至感受态细胞 5-α 大肠杆菌 细菌
   1. 将混合物和质粒加入细菌中，冰上孵育30分钟。
   2. 将混合物放入42 °C水浴中热激45秒，随后立即置于冰上冷却3分钟。
   3. 加入500 µL含有分解代谢物阻遏的超级优化肉汤（SOC）培养基，在37 °C下孵育1小时。
   4. 7000 × g 离心 g 孵育2分钟，移除大部分上清液。重悬菌体后涂布于含有适当选择性抗生素的LB（Luria Broth）琼脂平板上。
      注意： 本研究中使用了羧苄青霉素。
   5. 37 °C下培养过夜。用移液器枪头轻轻接触其中一个菌落，并将其转移至含有100 µg/mL羧苄青霉素的3 mL LB培养基中，以分离该菌落。37 °C下培养12–24小时。
   6. 使用质粒DNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取质粒DNA，并通过DNA测序验证序列。
6. 对于 Ypet/3' UTR：
   1. 生成用于线性PCR的模板 体外 转录。使用位于Ypet序列上游的正向引物，以及含有20个额外胸腺嘧啶残基的反向引物。Ypet/IL-7 3'非翻译区序列及正向和反向引物序列见表2。
      注意： 这些额外的胸腺嘧啶残基将在线性mRNA的3'端添加寡聚腺苷酸（oligo(A)） 体外 转录.
   2. 体外 使用T7转录试剂盒，按照制造商说明书将PCR产物转录。
   3. 使用转录纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所得的互补RNA（cRNA）。
   4. 用无RNase的水洗脱纯化的cRNA，测定浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳评估其完整性。于−80 °C保存。
7. 对于 mCherry：
   1. 生成线性PCR模板 体外 使用高保真限制性内切酶进行转录；若重复本示例，请使用限制性内切酶 mfEI-HF。在消化缓冲液中于 37 °C 过夜消化。
   2. 运行凝胶以纯化样品，并根据制造商说明书使用凝胶回收试剂盒提取线性DNA。
   3. 体外 使用T7转录试剂盒，按照制造商说明书将PCR产物转录。
   4. 使用 poly(A) 尾添加试剂盒，按照制造商说明书对 cRNA（150-200 个核苷酸）进行多聚腺苷酸化。
   5. 使用转录纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所得的cRNA。
   6. 用无RNase的水洗脱纯化的cRNA，测定mRNA浓度，并通过凝胶电泳评估mRNA完整性。于−80 °C保存。

3. 实验步骤

注意： 卵母细胞显微注射及后续延时显微镜观察的示意图概述如下所示 图1.

1. 第1天
   1. 向21日龄小鼠腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素，以促进卵泡发育至有腔卵泡阶段。
2. 第3天
   1. 卵母细胞采集
      1. 使用26 G针头在卵泡壁上做微小切口，小心打开有腔卵泡。用口控玻璃移液管分离带有数层卵丘细胞的完整卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。
      2. 使用较小的移液管（直径略大于卵母细胞），通过反复吹打机械去除COCs的卵丘细胞。
         注意：也可对完整的COCs进行显微注射。
      3. 使用较大的移液管吸取去卵丘的卵母细胞，并将其置于含有成熟培养基的培养皿中，培养基中添加1 µM磷酸二酯酶抑制剂西洛他唑，以防止减数分裂成熟过程的恢复。将培养皿放入培养箱中孵育2小时，使卵母细胞从卵泡分离所造成的应激中恢复。
   2. 卵母细胞显微注射
      1. 将一根10 cm长的硼硅酸盐玻璃毛细管放入机械拉针仪中制备注射针。为获得最佳注射效果，使用加热丝将针尖弯成45°角。
      2. 准备聚苯乙烯培养皿，内含20 µL基础卵母细胞采集培养基液滴，并用轻质矿物油覆盖液滴。
      3. 通过加入12.5 µg/µL Ypet-3' UTR和12.5 µg/µL mCherry制备报告基因混合物。建议配制较大体积并分装保存，以确保后续实验中报告基因浓度一致。分装后储存于-80 °C。解冻后，先以20,000 x g离心2分钟，再转移至新的微量离心管中。
         注意：此离心步骤可防止报告基因混合物中的潜在聚集体堵塞注射针。
      4. 通过毛细作用将约0.5 µL报告基因混合物吸入注射针中。
      5. 将持卵针和已装液的注射针插入显微操作仪的夹持器中，并置于卵母细胞采集培养基液滴内。向持卵针中吸入少量培养基。
      6. 轻轻敲击注射针与持卵针接触处，打开注射针。
      7. 将卵母细胞置于基础采集培养基液滴中，注射5–10 pL报告基因混合物。
      8. 将注射后的卵母细胞在含1 µM西洛他唑的成熟培养基中孵育16小时，使mCherry信号达到平台期。
      9. 准备一个用于延时显微成像的培养皿，每种注射的报告基因至少设置两个20 µL成熟培养基液滴：一个含1 µM西洛他唑，用于对照组（前期I阻滞卵母细胞）；另一个不含西洛他唑，用于成熟中的卵母细胞。用轻质矿物油覆盖液滴后放入培养箱。
   3. 延时显微成像
      1. 预孵育后，从培养箱中取出已注射的卵母细胞，在不含西洛他唑的成熟培养基中清洗四次。保留部分卵母细胞于含1 µM西洛他唑的成熟培养基中，作为前期I阻滞的对照组。
      2. 将注射后的卵母细胞转移至预先准备好的延时显微成像培养皿中的相应液滴中。使用封闭的玻璃移液管将卵母细胞聚集成簇（可通过将移液管尖端在火焰中加热数秒制备封闭移液管）。
         注意：聚集成簇有助于防止记录过程中卵母细胞移动。
      3. 将培养皿置于配备发光二极管照明系统、带环境控制腔室的电动载物台显微镜下，维持37 °C和5% CO₂条件。为重复本研究，请使用以下参数：滤光片组：YFP/CFP/mCherry二向色镜69008BS；YFP通道（激发（Ex）：S500/20 × 49057；发射（EM）：D535/30 m 47281），mCherry通道（Ex：580/25 × 49829；Em：632/60 m）。
      4. 输入延时实验的相应设置（参见材料表中本研究所用软件）：点击Apps | Multi-Dimensional Acquisition。选择第一个标签页Main，并选择timelapse, multiple stage positions和multiple wavelengths。
      5. 选择Saving标签页，输入实验数据保存位置。
      6. 选择Timelapse标签页，输入时间点数量、总时长和时间间隔。
         注意：延时实验的持续时间取决于所研究的动物物种，因为不同物种卵母细胞减数分裂成熟的时间存在差异。本实验中，小鼠卵母细胞每隔15分钟记录一次，持续16小时。
      7. 选择Stage标签页。打开明场，通过点击Acquire | Acquire | Show Live打开新窗口定位卵母细胞位置。定位后，切换回Multi-Dimensional Acquisition窗口，点击+号设定卵母细胞位置。
      8. 选择Wavelengths标签页，设置三种不同波长：明场（曝光15 ms）、YFP（Ypet/IL7 3' UTR，曝光150 ms）和mCherry（Ypet/IL7 3' UTR，曝光75 ms）。
         注意：根据每种Ypet/3' UTR报告基因的累积水平和注射体积调整曝光时间。确保实验开始时YFP信号处于检测范围的中心，以避免翻译激活时信号低估或饱和。对于mCherry，需根据每批mCherry在多聚腺苷酸化过程中添加的腺嘌呤核苷酸数量调整曝光时间。由于多聚腺苷酸化效率存在差异，建议在不同实验中使用同一批次的mCherry，以便更准确地比较实验结果。
      9. 点击Acquire开始延时实验。参见图1以了解单个卵母细胞延时记录的示例。
   4. Ypet-3' UTR翻译分析
      1. 进行此分析时（参见材料表中本研究所用软件），对每个卵母细胞进行两个区域测量：卵母细胞本身——点击ellipse region并圈选卵母细胞——以及靠近卵母细胞的一个小区域，用于背景扣除——点击rectangular region。
         注意：确保在延时记录期间卵母细胞未移出所选区域。特别注意在极体排出阶段的区域测量位置，因为此过程会引起卵母细胞移动，可能影响记录结果的准确性。
      2. 通过先点击Open Log，再点击Log Data，将区域测量数据导出至电子表格中。
      3. 对每个单独的卵母细胞及所有测量时间点，分别从卵母细胞区域测量值中减去背景区域测量值。YFP和mCherry波长的数据需分别处理。

表1：培养基的制备。 配制基础卵母细胞采集培养基和卵母细胞成熟培养基所需添加的成分列表。

基础卵母细胞采集培养基
组分	配制 500 mL
HEPES 修饰的 Eagle 最低必需培养基	7.1 g
碳酸氢钠	252 mg
丙酮酸钠	1.15 mL
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液	5 mL
超纯蒸馏水（Invitrogen，10977-015）	加至 500 mL
成熟培养基
组分	配制 500 mL
MEM alpha 1x	加至 500 mL
丙酮酸钠	1.15 mL
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液	5 mL

表2：报告基因与引物序列示例 YFP/IL7 3'UTR 报告基因的序列以及用于扩增线性PCR模板的上下游引物序列 体外 转录

	序列
Ypet/白细胞介素-7 3’非翻译区	GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTG CCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGGGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCA TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAG TACAACTACAACAGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCA TCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCCGGCATCACCGAGGGC ATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGACATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTT CATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAGAAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATGAGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATA CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTCTAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTCTT AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAGACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGCAGCAG CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA ACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTTTGGCATTCTGTCTGTCTCT CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATCTATCTATATATATAATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACACTGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAG TGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACACATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAAAACACTAATTTCTTGTTTTATAGTAGGGTC TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGCCAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTATGTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGT CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTTTTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCT GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTTTCCCCAACCCCTATAATGCTCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAAAC ACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTTTCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGT GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT TTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT
正向引物	GAGAACCCACTGCTTAC
反向引物	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTGCCAAAATC

结果

图1：单个卵母细胞延时记录示例。 对单个卵母细胞进行明场、YFP 和 mCherry 成像，该卵母细胞在第一次减数分裂前期被注射编码 Ypet/白细胞介素-7 3' 非翻译区（UTR）的 mRNA 以及多聚腺苷酸化的 mCherry mRNA，图像分别采集于第一次减数分裂中期（MI，雷帕霉素释放后6小时）和第二次减数分裂中期（MII，雷帕霉素释放后15小时）。比例尺 = 25 µm。缩写：YFP = 黄色荧光蛋白；GV = 生发泡；MI = 第一次减数分裂中期；MII = 第二次减数分裂中期。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基的制备
牛血清白蛋白粉末 Bioxtra	Sigma-Aldrich	SIAL-A3311
西洛他胺	EMD Millipore	231085
MEM alpha	Gibco	12561-056
最低必需培养基 Eagle	Sigma-Aldrich	M2645
青霉素-链霉素 100 倍溶液，无菌过滤	Genesee Scientific Corporation (GenClone)	25-512
碳酸氢钠	JT-Baker	3506-1
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
超纯蒸馏水	Invitrogen	10977-015
编码 YFP/3' UTR 和 mCherry 的 mRNA 制备
琼脂糖	Apex Biomedical	20-102QD
羧苄青霉素二钠盐	Sigma-Aldrich	C1389-1G
Choo-Choo 克隆试剂盒	McLab	CCK-20
CutSmart 缓冲液 (10x)	New England Biolabs	B7204
DNA 上样染料 (6x)	Thermo Scientific	R0611
dNTP 溶液	New England Biolabs	N0447S
DpnI	New England Biolabs	R0176
GeneRuler 1 kb DNA 标准分子量标记	Thermo Fisher	SM1333
含 100 µg/mL 羧苄青霉素的 LB 琼脂平板，Teknova	Teknova	L1010
LB 培养基（胶囊）	MP Biomedicals	3002-021
MEGAclear 转录纯化试剂盒	Life Technologies	AM1908
MfeI-HF 限制性内切酶	New England Biolabs	R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 转录试剂盒	Invitrogen	AM1344
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530
多聚(A) 尾添加试剂盒	Invitrogen	AM1350
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒	Qiagen	27106
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
S.O.C. 培养基	Thermo Fisher	15544034
TAE 缓冲液	Apex Biomedical	20-193
超纯溴化乙锭溶液	Life Technologies	15585011
卵母细胞采集
用于校准微量移液器的抽吸管组件	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
校准微量移液器	Drummond Scientific Company	2-000-025
PMSG-5000	Mybiosource	MBS142665
PrecisionGlide 针头 26 G x 1/2	BD	305111
1 ml 注射器	BD	309659
卵母细胞显微注射
35 mm 培养皿 | No. 0 盖玻片 | 20 mm 玻璃直径 | 未包被	MatTek	P35G-0-20-C	用于延时显微成像
含丝硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument	BF100-78-10
胚胎培养用油	Irvine Scientific	9305
培养皿	Falcon	351006	用于显微注射
组织培养皿	Falcon	353001	用于卵母细胞孵育
VacuTip 固定毛细管	Eppendorf	5195000036
软件
Biorender	BioRender		图 1S 的制备
MetaMorph，版本 7.8.13.0	Molecular Devices		 用于延时显微成像及 3' UTR 翻译分析