肠道酸化监测实验：一种研究肠腔酸化的方法 果蝇 使用溴酚蓝染料

摘要

来源：Abu, F., 等. 监测成年Drosophila肠道的酸化过程. J. Vis. Exp. (2021).

本视频展示了一种用于监测肠道酸化的实验方法 果蝇 果蝇。在摄入添加了pH指示染料的食物后，肠道腔内的酸化会导致染料颜色发生变化。通过肉眼观察果蝇消化道的颜色改变，可作为肠道酸化的证据。

方案

注意：使用标准实验室品系 Oregon R 作为野生型对照。所有果蝇均在室温下、12/12 小时光照/黑暗昼夜节律条件下，饲养于标准玉米粉-糖蜜培养基（含糖蜜、琼脂、酵母、玉米粉、丙酸、山梨酸及水）中。

1. 准备实验

1. 在 CO₂ 麻醉下收集雌性果蝇（0-2 日龄，非处女蝇），并在标准玉米粉培养基上恢复至少 3 天后进行实验。
2. 将果蝇置于含有浸有约 2 mL 去离子水的实验室擦拭纸的试管中，在室温（约 23 °C）下饥饿处理约 24 小时。
3. 按如下步骤制备含溴酚蓝（BPB）的果蝇食物：
   1. 将果蝇食物在微波炉中融化，然后冷却至温热状态。
   2. 向 1 mL 温热的食物中加入 1 mL 4% 的 BPB 溶液，并充分混匀。
   3. 用移液器将含有 BPB 的果蝇食物以单点形式（约 200 µL）加至培养皿中央。

2. 肠道酸化监测实验

1. 将饥饿处理的果蝇转移至含有单个点状（200 µL）果蝇食物的培养皿中，该食物中添加了2%溴酚蓝（BPB）。在室温光照条件下让果蝇自由取食4小时。
2. 4小时后，收集果蝇并用冰进行麻醉；手术分离其肠道。
   1. 在体视显微镜下，使用镊子于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中进行手术操作（参见材料表）。用一对镊子夹住果蝇胸部，再用另一对镊子向下牵拉腹部，直至露出肠道的后肠连接区（CCR），注意保持肠道两端均与组织相连，完成肠道的分离。
3. 通过观察肠道后肠连接区（CCR）的颜色判断其酸化情况（图1C；黄色表示已酸化，蓝色表示未酸化）。
4. 仅统计肠道中BPB染色明显的果蝇。
5. 使用以下公式计算百分比：
   肠道酸化的果蝇百分比 =（酸化果蝇数 × 100）/（酸化果蝇数 + 未酸化果蝇数）
   注意：0%表示无果蝇肠道发生酸化，100%表示所有果蝇肠道均发生酸化。

结果

图1：肠道酸化监测。（A）进食区域的示意图。蓝色点代表含有溴酚蓝（一种pH指示染料）的果蝇食物。其他点代表果蝇。（B）进食不同时间（最长4小时）后显示肠道酸化的果蝇百分比的图示。代表性图像显示酸化肠道与非酸化肠道。红色箭头指示中肠铜细胞区域的酸性物质释放。n = 4次实验，每次实验使用25–30只雌性果蝇。比例尺 = 每个500 µm。星号表示与对照组相比具有显著差异（单因素方差分析，随后进行Bonferroni检验）*P < 0.05；**P < 0.01；****P < 0.0001。（C）果蝇在23 °...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溴酚蓝	Sigma-Aldrich		B0126
<em>D. simulans</em>	<em>果蝇 </em>加利福尼亚大学物种保藏中心		加利福尼亚州里弗赛德1（https://www.drosophilaspecies.com/）
<em>D. erecta</em>	<em>黑腹果蝇 </em>加利福尼亚大学物种保藏中心		Dere cy1（https://www.drosophilaspecies.com/）
<em>D. pseudoobscura</em>	<em>果蝇</em> 加利福尼亚大学物种保藏中心		美国俄勒冈州尤金市（https://www.drosophilaspecies.com/）
<em>D. mojavensis</em>	<em>果蝇 </em>加利福尼亚大学物种保藏中心		加利福尼亚州巧克力山脉（https://www.drosophilaspecies.com/）
镊子	Inox Biology		目录号 11252-20
金用纸巾擦拭组织	Kimtech
Oregon R	布卢明顿 <em>果蝇 </em>储备液		（https://bdsc.indiana.edu/ # 2376）
培养皿	Fisher Scientific		目录编号 FB0875713A
磷酸盐缓冲液（PBS）	HyClone		目录号 SH30258.01
体视显微镜	Olympus SZ51		视觉放大