线粒体钙摄取检测：一种基于酶标仪的分离线粒体钙摄取测量方法

摘要

来源：Maxwell, J.T.，等，分离线粒体和培养细胞中线粒体钙离子内流的分析。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种基于酶标仪的检测方法，用于测量分离线粒体中的线粒体钙离子摄取。该方法通过分析钙敏感性荧光染料的荧光信号，研究线粒体钙离子摄取的动力学过程以及钙超载现象。

方案

1. 试剂与溶液

1. 制备 500 mL 用于线粒体分离的 MS-EGTA 缓冲液：225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA），用 KOH 调节 pH 至 7.4。通过 0.22 μm 滤器灭菌，并在 4 °C 下保存。使用前确保 MS-EGTA 缓冲液已预冷至 4 °C。
2. 制备 100 mL KCl 缓冲液：125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH₂PO₄、2 mM MgCl₂、40 μM EGTA，用 KOH 调节 pH 至 7.2。室温保存。
3. 在二甲基亚砜（DMSO）中制备 1 mM 钙绿-5N 储存液。钙绿-5N 储存液可分装后于 -20 °C 保存。
4. 制备 Ca²⁺ 摄取的底物。
   1. 制备 1 M 丙酮酸钠溶液，pH 7.4。分装后于 -20 °C 保存。
   2. 制备 500 mM 苹果酸溶液，pH 7.4。分装后于 -20 °C 保存。

2. 心脏线粒体的分离

1. 根据机构标准对小鼠实施安乐死。
   注意： 在本机构批准的安乐死方法....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备注射器的 Synergy Neo2 多功能微孔板读板仪	Biotek
组织匀浆器	Kimble	886000-0022
96 孔板	Corning	3628
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
DMSO	Invitrogen	D12345
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
氯化钾	Fisher	BP366-500
氯化镁	Sigma	M2670
丙酮酸钠	Sigma	P2256
L-苹果酸	Sigma	M1125
氯化钙	Sigma	C4901
磷酸二氢钾	Sigma	P0662