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1. 试剂和溶液
- 制备 500 mL 用于线粒体分离的 MS-EGTA 缓冲液:225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、5 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES）、1 mM 乙二醇-双（β-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸 （EGTA），用 KOH 调节 pH 至 7.4。通过 0.22 μm 过滤器对其进行消毒并储存在 4 °C。确保在使用前将 MS-EGTA 缓冲液预冷至 4 °C。
- 准备 100 mL KCl 缓冲液:125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH2PO4、2 mM MgCl2、40 μM EGTA 和用 KOH 调节 pH 值至 7.2。在室温下储存。
- 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 1 mM 钙绿-5N 原液。钙绿-5N 原液可以分装并储存在 -20 °C。
- 准备用于 Ca2 + 摄取的底物。
- 制备 1 M 丙酮酸钠，pH 7.4。将其等分试样储存在 -20 °C。
- 制备 500 mM 苹果酸盐，pH 7.4。将其等分试样储存在 -20 °C。
2. 心脏线粒体的分离
- 根据机构标准对小鼠实施安乐死。
注意:对于我们机构批准的安乐死方法，小鼠通过异氟烷吸入麻醉，并通过宫颈脱位处死。
- 通过打开胸腔，沿肋骨的两侧切割，从心脏两侧切开，切掉隔膜，切除心脏组织来收集心脏><。
注意:在该方案中，从从成年小鼠（约 120 毫克）收集的整个心脏中进行线粒体分离，这应该足以进行 3-4 次实验。对于从其他富含线粒体的组织（如肝脏）中分离线粒体，可以按照所述方案使用多达 200 mg 的组织。
- 用 25 mL 冰冷的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 彻底冲洗组织，确保所有血液都从心室中挤出。
注意:当从心脏中挤出的液体清澈时，心脏将被充分冲洗。
- 用一把锋利的剪刀在 5 mL 冰冷的 1x PBS 中将心脏切成小块。
- 丢弃 PBS，将切碎的心脏组织转移到间隙为 0.10 至 0.15 mm 的预冷 7 mL 玻璃特氟龙 Dounce 匀浆器中。
- 加入 5 mL 冰冷的 MS-EGTA 缓冲液，匀浆样品，直到组织块不再可见（约 11 次冲程><）。
注意:不要过度匀浆组织，因为目标是获得完整且功能性的线粒体。
- 将匀浆转移到 15 mL 试管中。
- 将匀浆在 4 °C 下以 600 x g 离心 5 分钟，以沉淀细胞核和未破碎的细胞。
- 将上清液转移到新鲜的 15 mL 试管中，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟以沉淀线粒体。
- 弃去上清液，将线粒体沉淀保持在冰上。
- 使用冰冷的 MS-EGTA 缓冲液洗涤线粒体沉淀两次。每次洗涤时，将线粒体沉淀重悬于 5 mL MS-EGTA 缓冲液中，在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟，并弃去上清液。
- 最后一次洗涤后，弃去上清液，将线粒体重悬于 100 μL 冰冷的 MS-EGTA 缓冲液中。将线粒体保持在冰上.
注意:线粒体应在 1 小时内用于实验。
- 使用 Bradford 蛋白测定法测量线粒体蛋白浓度。
3. 基于读板器的线粒体钙摄取测量
注意:这里描述了使用装有注射器的多功能读板器分析线粒体 Ca2+ 摄取的方案。可以使用任何能够在动力学模式下读取钙绿-5N 荧光（激发/发射波长为 506/532 nm）的读板器，并带有自动试剂进样器，以保持反应避光。
- 对酶标仪进行编程，以执行钙绿-5N 荧光的动力学读数，每秒进行一次测量，总检测时间为 1,000 秒。此外，对试剂进样器进行编程，使其在 30 s、150 s、300 s、480 s 和 690 s 时间点分配 5 μL CaCl2 溶液><。
注意:CaCl2 进样的时间由用户自定义，可根据实验需要进行调整。
- 用要使用的 CaCl2 溶液灌注试剂注射器。
注意:CaCl2 溶液的浓度由用户自定义，可在后续运行中进行调整，以滴定触发 MPTP 开口所需的 Ca2+ 量。
- 将 200 μg 线粒体添加到 96 孔板的单个孔中。
- 向孔中加入适当体积的 KCl 缓冲液，使线粒体和 KCl 缓冲液的总体积达到 197 μL。
- 向线粒体混合物中加入 1 μL 1 M 丙酮酸和 1 μL 500 mM 苹果酸。轻轻吸取移液混合，并在室温下将线粒体与底物孵育 2 分钟，以使线粒体通电。
- 加入 1 μL 1 mM 钙绿-5N 原液。通过移液轻轻混匀。
注意:在加入钙绿-5N 染料后保护反应避光。
- 启动预编程的动力学方案并监测钙绿 5N 荧光。