线粒体钙摄取检测：一种基于酶标仪的分离线粒体钙摄取测量方法

摘要

来源：Maxwell, J.T.，等，分离线粒体和培养细胞中线粒体钙离子内流的分析。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种基于酶标仪的检测方法，用于测量分离线粒体中的线粒体钙离子摄取。该方法通过分析钙敏感性荧光染料的荧光信号，研究线粒体钙离子摄取的动力学过程以及钙超载现象。

方案

1. 试剂与溶液

1. 制备 500 mL 用于线粒体分离的 MS-EGTA 缓冲液：225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA），用 KOH 调节 pH 至 7.4。通过 0.22 μm 滤器灭菌，并在 4 °C 下保存。使用前确保 MS-EGTA 缓冲液已预冷至 4 °C。
2. 制备 100 mL KCl 缓冲液：125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH₂PO₄、2 mM MgCl₂、40 μM EGTA，用 KOH 调节 pH 至 7.2。室温保存。
3. 在二甲基亚砜（DMSO）中制备 1 mM 钙绿-5N 储存液。钙绿-5N 储存液可分装后于 -20 °C 保存。
4. 制备 Ca²⁺ 摄取的底物。
   1. 制备 1 M 丙酮酸钠溶液，pH 7.4。分装后于 -20 °C 保存。
   2. 制备 500 mM 苹果酸溶液，pH 7.4。分装后于 -20 °C 保存。

2. 心脏线粒体的分离

1. 根据机构标准对小鼠实施安乐死。
   注意： 在本机构批准的安乐死方法中，小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉，随后以颈椎脱位法处死。
2. 打开胸腔，沿肋骨两侧剪开，暴露心脏，剪除膈肌，取出心脏组织。
   注意： 在本方案中，线粒体分离使用成年小鼠完整心脏（约 120 mg），足以进行 3–4 次实验。若从其他富含线粒体的组织（如肝脏）中分离线粒体，可采用本方案并使用最多 200 mg 组织。
3. 用 25 mL 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）彻底冲洗组织，确保将心室中的全部血液挤出。
   注意： 当从心脏挤出的液体变得澄清时，表明冲洗充分。
4. 使用一把锋利的剪刀，在 5 mL 冰冷的 1× PBS 中将心脏剪成小块。
5. 弃去 PBS，将剪碎的心脏组织转移至预冷的 7 mL 玻璃-聚四氟乙烯（Teflon）Dounce 匀浆器中，匀浆器间隙为 0.10 至 0.15 mm。
6. 加入 5 mL 冰冷的 MS-EGTA 缓冲液，匀浆至组织碎片不可见（约 11 次冲捣）。
   注意： 避免过度匀浆，因为本步骤的目标是获得完整且具有功能的线粒体。
7. 将匀浆液转移至 15 mL 离心管中。
8. 在 4 °C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞核和未破裂的细胞。
9. 将上清液转移至新的 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，沉淀线粒体。
10. 弃去上清液，将线粒体沉淀置于冰上保存。
11. 使用冰冷的 MS-EGTA 缓冲液洗涤线粒体沉淀两次。每次洗涤时，将线粒体沉淀重悬于 5 mL MS-EGTA 缓冲液中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，然后弃去上清液。
12. 最后一次洗涤后，弃去上清液，将线粒体重悬于 100 μL 冰冷的 MS-EGTA 缓冲液中，置于冰上保存。
    注意： 线粒体应在 1 小时内用于实验。
13. 使用 Bradford 蛋白质定量法测定线粒体蛋白浓度。

3. 基于酶标仪的线粒体钙离子摄取测量

注意： 此处描述的是使用配备注射器的多功能酶标仪分析线粒体 Ca²⁺ 摄取的实验方案。任何能够在避光条件下以动力学模式读取钙绿-5N 荧光（激发/发射波长为 506/532 nm）并具备自动试剂注射功能的酶标仪均可使用。

1. 设置酶标仪以每秒一次的频率对钙绿-5N荧光进行动力学检测，总检测时间为1,000秒。同时，设置试剂注射器在30秒、150秒、300秒、480秒和690秒时间点分别注入5 μL的CaCl₂溶液。
   注意： CaCl₂注射的时间由用户自行定义，可根据实验需求进行调整。
2. 用待使用的CaCl₂溶液预润试剂注射器。
   注意： CaCl₂溶液的浓度由用户自行定义，可在后续实验中调整，以滴定诱导MPTP开放所需的Ca²⁺量。
3. 向96孔板的单个孔中加入200 μg线粒体。
4. 向孔中加入适量KCl缓冲液，使线粒体与KCl缓冲液的总体积达到197 μL。
5. 向线粒体混合物中加入1 μL的1 M丙酮酸钠和1 μL的500 mM苹果酸。轻轻吹打混匀，并在室温下孵育2分钟，使线粒体充分活化。
6. 加入1 μL的1 mM钙绿-5N储备液。轻轻吹打混匀。
   注意： 加入钙绿-5N染料后，应避免反应体系暴露于光线下。
7. 启动预设的动力学检测程序，监测钙绿-5N荧光信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备注射器的 Synergy Neo2 多功能微孔板读板仪	Biotek
组织匀浆器	Kimble	886000-0022
96 孔板	Corning	3628
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
DMSO	Invitrogen	D12345
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
氯化钾	Fisher	BP366-500
氯化镁	Sigma	M2670
丙酮酸钠	Sigma	P2256
L-苹果酸	Sigma	M1125
氯化钙	Sigma	C4901
磷酸二氢钾	Sigma	P0662