来源：Konate, K. 等. 利用荧光泄漏实验研究穿膜肽对细胞膜稳定性的破坏作用。J. Vis. Exp. (2020)
本视频介绍了荧光泄漏实验，该实验利用细胞膜模拟物——即包裹有荧光染料和淬灭剂的大单层囊泡（LUVs），研究穿膜肽与细胞膜之间的相互作用。
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荧光泄漏实验研究穿膜肽与膜的相互作用
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 大单层囊泡（LUVs）的制备
- 制备大单层囊泡（LUV），用于作为荧光泄漏实验中的细胞膜模拟物。
- 使用 Hamilton 玻璃注射器，在 25 mL 玻璃圆底烧瓶中，按 4:4:2 的摩尔比混合磷脂酰胆碱（DOPC，786.11 g/mol）、鞘磷脂（SM，760.22 g/mol）和胆固醇（Chol，386.65 g/mol）。脂质溶液由每种脂质在甲醇/氯仿（3/1，体积/体积）溶剂中的储存液（25 mg/mL）配制而成。根据 4 µmol DOPC、4 µmol SM 和 2 µmol Chol 的用量，分别从储存液中取 126 µL、117 µL 和 31 µL 混合。
注意：甲醇为有毒且易燃的溶剂，氯仿具有毒性并可能致癌。两者均应在通风橱内佩戴适当防护装备操作。 - 在 60 °C 下使用旋转蒸发仪在减压条件下蒸发甲醇/氯仿，持续 45–60 分钟，直至形成干燥的脂质薄膜。
- 配制两种 HEPES 缓冲液储存液。HEPES 缓冲液 1：将 20 mM HEPES（238.3 g/mol）与 75 mM NaCl（58.44 g/mol）混合，并调节 pH 至 7.4。HEPES 缓冲液 2：将 20 mM HEPES 与 145 mM NaCl 混合，并调节 pH 至 7.4。HEPES 缓冲液可在 4 °C 下保存 1 个月。
注意：建议使用渗透压计检测缓冲液的渗透压。 - 通过将膜不可渗透的荧光染料-猝灭剂对——8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐（ANTS，427.33 g/mol，12.5 mM）和对二甲苯双吡啶溴化物（DPX，422.16 g/mol，45 mM）——溶解于 HEPES 缓冲液中，配制脂质水合溶液。ANTS 与 DPX 混合后形成黄色溶液。为达到 12.5 mM ANTS 和 45 mM DPX 的浓度，分别将 21.4 mg 和 76 mg 溶解于 4 mL HEPES 缓冲液 1 中。
注意：脂质水合溶液可在 4 °C 下避光保存 2 周（用铝箔包裹试管）。 - 通过向干燥脂质膜中加入 1 mL 脂质水合溶液并涡旋振荡，使其充分重悬以重构多层囊泡（MLV），直至干燥脂质膜完全溶解。确保溶液完全溶解，因残留的小脂质聚集体将对后续步骤产生不利影响。同时检查玻璃圆底烧瓶内壁，确保无残留脂质膜。
注意：溶解后溶液呈乳光、淡黄色。 - 对囊泡进行五次冻融循环以获得单层囊泡。每次循环将玻璃圆底烧瓶置于液氮中 30 秒以完成冷冻，随后转移至水浴中 2 分钟以完成解冻。
注意：水浴温度应比脂质的相变温度高 5–10 °C。 - 将两个滤膜支撑架预先用 HEPES 缓冲液润湿后，分别插入金属挤出器筒体内的聚四氟乙烯（PTFE）挤出器部件中，完成脂质挤出器的组装。
- 在其中一个滤膜支撑架上方放置一片经 HEPES 缓冲液润湿的聚碳酸酯膜（孔径 0.1 µm，直径 25 mm）。
- 将两个金属挤出器筒体组装并拧紧。
- 将组装好的挤出器置于支架中，并在每个聚四氟乙烯挤出器部件末端的适当孔位中插入 1 mL 注射器。挤出过程即为待测液体通过聚碳酸酯膜从一个注射器转移至另一个注射器。
- 使用 1 mL HEPES 缓冲液注入其中一个 1 mL 注射器，测试挤出器是否泄漏或存在其他问题。
- 将 1 mL HEPES 缓冲液替换为 MLV 样品。
- 通过聚碳酸酯膜将 MLV 样品在两个注射器之间反复挤出至少 21 次，以获得尺寸均一的大单层囊泡（LUV）。
注意：挤出过程应在高于脂质混合物相变温度的条件下进行。
2. 大单层囊泡（LUVs）的纯化
- 准备柱层析纯化，以去除未包封的 ANTS 和过量的 DPX。
- 将交联葡聚糖凝胶（G-50）用含 0.01% NaN3（65 g/mol）的水相介质重悬后，加入液相色谱柱中（Luer Lock，无夹套，1.0 cm × 20 cm，床体积 16 mL），填充至柱子无色部分顶端下方约 1 cm 处。
- 打开活塞，让液体流出，使交联葡聚糖凝胶沉降稳定。
- 用 20 mL HEPES 缓冲液 2 对柱子进行洗涤，并弃去流出液。
- 当柱床上方溶剂的死体积最小化（<100 µL）但仍足以防止交联葡聚糖凝胶干燥时，关闭活塞。
- 将新挤出的 LUVs（黄色）加至柱顶，并使其进入交联葡聚糖凝胶中。
- 持续向柱中添加 HEPES 缓冲液 2，以完成 LUVs 的纯化。
- 洗脱约 2 mL HEPES 缓冲液 2（注意定期补充柱顶液体，避免交联葡聚糖凝胶干燥）：游离的黄色 ANTS 和 DPX 溶液迁移速度比脂质体慢。
- 开始用离心管（1.5 mL）收集纯化的 LUVs。
- 观察柱子流出的液滴，当液滴呈现乳光时，表明含有脂质体。此时更换收集管以回收含 LUVs 的组分。
- 继续洗脱至液滴不再呈现乳光（约 1 mL）。随后再用另一管单独收集 0.5 mL 洗脱液，然后停止洗脱。
注意：目前已有多种不同分子量的标准品，可作为试剂盒或单个分子量标准品，用于校准 LUVs 的洗脱体积。 - 用铝箔包裹含有 LUVs 的收集管，避免荧光染料发生漂白。
- 用 20 mL HEPES 缓冲液 2 清洗柱子。
- LUVs 可在 4 °C 下保存一周。
注意：由于 LUVs 的稳定性可能受其浓度、组成以及离子强度的影响，在每次实验前应使用动态光散射（DLS）仪器检测 LUVs 的粒径和均一性（见第 4 节：LUVs 粒径与均一性的表征）。
3. LUV 浓度的定量
- 使用磷脂定量试剂盒估算大单层囊泡（LUV）浓度，该试剂盒可检测胆碱浓度。当含胆碱极性头部的磷脂占比较大（>50%的LUVs）时，可应用此方法。
- 将18 mg显色底物溶解于提供的3 mL缓冲液中，配制显色试剂。
- 取一个10 × 10 × 45 mm的聚苯乙烯比色皿，加入3 mL显色试剂。
- 以纯显色试剂作为空白对照（空白）。向测试组加入20 µL LUV样品（测试），或向标准组加入20 µL已知胆碱浓度的标准溶液（标准品）。
- 充分混匀后，将所有组别（空白、测试和标准品）在37 °C下孵育5分钟。
- 使用分光光度计，在600 nm波长下，以空白溶液为对照，测定测试样品和标准溶液的吸光度（光密度，OD）。
- 根据测得的OD值，与已知浓度的标准品比较，计算LUV的脂质浓度C[LUV]（以胆碱当量表示）。
- 使用以下公式进行计算：
C[LUV] (mol / l) = (OD 样品 / OD 标准品) × C[标准品] (mol / l)
注意：磷脂定量试剂盒提供的胆碱氯化物标准溶液浓度为139.6 mg/l（相当于54 mg/dL），其摩尔浓度为C[标准品] = 3.87 mmol/L。OD 样品和OD 标准品分别为LUV溶液和胆碱溶液在600 nm处测得的吸光度。
4. 大单层囊泡大小和均一性的表征
- 使用动态光散射（DLS）仪器进行测量，以确定大单层囊泡（LUV）的尺寸（单位：nm）和多分散指数（PdI）。
- 通过设定溶剂/缓冲液的黏度及所用比色皿参数，编程设定相应的“标准操作程序”（SOP）。
- 将500 µL的LUV溶液加入聚苯乙烯半微量比色皿中。
- 将聚苯乙烯半微量比色皿插入DLS仪器中。
- 在室温下，测量颗粒分布的尺寸分布，包括平均尺寸（Z-平均值）和均一性（多分散指数，PdI）。
- 所有结果均来自两次独立测量，每次测量包含三个重复循环。
注意：LUV的标准值为平均尺寸137 ± 7 nm，PdI为0.149 ± 0.041。
5. 准备多肽溶液
- 制备用于渗漏实验分析的肽段储备液。
- 将肽段粉末（>95% 纯度）溶解于纯水中（例如，1 mg 肽段溶于 500 µL 纯水中）。
注意：建议在纯水中稀释肽段，避免使用二甲基亚砜（DMSO）溶解，因其可能引起假象（如膜通透性增加）。 - 将肽段溶液涡旋振荡 5 秒。
- 将肽段溶液置于水浴超声仪中超声处理 5 分钟，随后在 12,225 × g 条件下离心 5 分钟。收集上清液用于浓度测定。
- 测定三种独立稀释的肽段溶液在 280 nm 处的吸光度，并根据其摩尔消光系数 ε（取决于肽段序列中色氨酸和酪氨酸的含量）及比尔-朗伯定律计算肽段浓度。
注意：若肽段含有色氨酸和酪氨酸，则摩尔消光系数 ε 按照色氨酸 ε = 5,690 M-1cm-1 和酪氨酸 ε = 1,280 M-1cm-1 计算。若肽段序列中不含色氨酸或酪氨酸，可采用其他比色法测定浓度（如 BCA 法或 Bradford 法）。 - 将肽段溶液用纯水稀释至终浓度为 100 µM，并在 4 °C 下保存。
注意：在纯水中，4 °C 保存期间不会发生肽段降解。但应每两周测定一次肽段浓度，以确保无水分蒸发。
6. 荧光泄漏实验
- 在室温下使用荧光分光光度计测量荧光泄漏实验。激发波长和发射波长分别固定为 Ex = 360 nm ± 3 nm 和 Em = 530 nm ± 5 nm。
- 在石英荧光比色皿中，用 1 mL HEPES 缓冲液 2 将 LUVs 稀释至终浓度为 100 µM。实验过程中加入磁力搅拌子以使溶液均匀混合。
- 在 t = 0 s 至 t = 99 s 的前 100 秒内单独测量 LUVs，以获取背景荧光。
注意：也可在整个实验过程（15 分钟）中持续测量单独的 LUVs，以评估背景荧光及可能发生的泄漏。 - 随后，在接下来的 900 秒（15 分钟）内，通过逐次加入不同体积的肽溶液，测量荧光强度的增加，从而测定泄漏情况。本方案针对每种测试的肽浓度（从 0.1 µM 到 2.5 µM）分别进行。
- 最后，在 t = 1,000 s 至 t = 1,100 s 期间，加入 1 µL 的 Triton X-100（0.1%，v/v）使 LUVs 完全溶解，从而实现探针的完全去猝灭，获得 100% 荧光信号。
7. 渗漏量的定量分析
- 为使每种测试条件下数据点数量一致，需去除 t = 1,090 s 之后获得的数值。
- 通过计算 t = 0 s 至 t = 49 s 之间 50 个数据点的平均值，确定最小荧光强度 Fmin（仅含 LUVs）。
- 通过计算 t = 1,041 s 至 t = 1,090 s 之间 50 个数据点的平均值，确定最大荧光强度 Fmax（含 Triton X-100 的 LUVs）。
- 根据以下公式计算每个时间点（t = x）的泄漏百分比（%Leak）：
%Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) × 100 - 对相同条件下不同 LUV 制备批次（n ≥ 2）所得数据计算平均值和标准差。
- 绘制泄漏百分比 %Leak(t=x) 随时间（s）变化的曲线图。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 mL 玻璃圆底烧瓶 | Pyrex | ||
| 8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐（ANTS） | Invitrogen | A350 | 避光保存 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC（二油酰基磷脂酰胆碱） | Avanti Polar | 850375P | 防止接触空气 |
| 挤出器 | Avanti Polar | 610000 | |
| 荧光分光光度计 | PTI Serlabo | ||
| 50 µL 玻璃注射器 | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay 磷脂检测试剂盒 | WAKO | 296-63801 | |
| 液相色谱柱 | Sigma-Aldrich | ||
| 甲醇 | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore 聚碳酸酯膜（孔径 0.1 µm，直径 25 mm） | Whatman | 800309 | |
| 聚苯乙烯比色皿，10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| 聚苯乙烯半微量比色皿，DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| 对二甲苯双吡啶溴化物（DPX） | Invitrogen | X1525 | 避光保存 |
| 石英荧光比色皿 | Hellma | 109.004F-QS | |
| 旋转蒸发系统 | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 树脂 | Amersham | 17-0042-01 | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 超声波清洗仪 USC300T | VWR | 142-6001 | |
| 鞘磷脂 | Avanti Polar | 860062P | 防止接触空气 |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetasizer NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
