可溶性蛋白测定法定量植物组织中的可溶性蛋白含量

1. 植物采集和加工

1. 采集和处理植物样品
   1. 收集植物样品后，用镊子将植物材料浸入液氮中，快速冷冻样品，并储存在-80°C。如果收集的植物样品太大而无法快速冷冻，请使用干冰快速冷却样品并尽快转移到 -80 °C 冰箱中。组织与植物分离后，植物材料的常量营养素含量会发生变化，因此在采集后尽快冷冻植物样品很重要><。 注意: 液氮与皮肤接触会导致严重冻伤。请确保将液氮放在经批准的容器中运输，并在处理液氮时穿戴适当的个人防护装备，包括冷冻手套、护目镜、面罩、围裙和实验服。
   2. 使用冷冻干燥机冻干植物材料，以确保在去除水分时组织代谢失活。干燥直至样品质量稳定，以确保去除所有水分。
   3. 样品干燥后，使用研磨机或研磨机研磨成细粉。将样品储存在干燥柜中直至分析。

2. 可溶性蛋白检测

1. 样品制备
   1. 称取每个组织的重复样品（每个约 20 mg）放入 1.5 mL 聚苯乙烯微量离心管和标记管中。这些样本随后将被称为未知样本。记录每个样品的精确质量，因为计算每个未知样品中的可溶性蛋白质百分比需要此信息。使用带锁盖的微量离心管，因为在后续加热步骤中，非锁盖可能会打开，从而导致样品溶液损失。
2. 溶解和分离未知样品蛋白
   1. 使用微量移液器，向每个试管中加入 500 μL 0.1 M NaOH。盖紧盖子并超声处理 30 分钟。将热水浴预热 90 °C.
      注意:氢氧化钠是一种强碱，与皮肤接触会导致灼伤。虽然 0.1 M NaOH 代表低浓度，但请戴上防护手套以避免刺激皮肤。
   2. 将试管放在热水浴中的架子上 15 分钟。
   以
   3. 15,000 x g 离心管 10 分钟。将上清液移液到新标记的微量离心管中，对每个样品使用新的移液器吸头。向含有沉淀物的试管中加入 300 μL 0.1 M NaOH，再次以 15,000 x g 离心 10 分钟。再次收集上清液并将其与来自同一样品的其他上清液混合。这是一个潜在的停止点，如果需要，样品可以在 4 °C 下储存过夜。
3. 沉淀植物蛋白
   1. 加入 11 μL 5.8 M HCl 中和上清液的 pH 值。将石蕊试纸浸入每个样品溶液中，确认 pH 值为 ~7。
      注意:盐酸是一种强腐蚀性酸，与皮肤接触（皮肤涂抹或吸入）会导致灼伤。处理 HCl 时请戴上手套，以防止皮肤刺激。
   2. 向每管中加入 90 μL 100% 三氯乙酸 （TCA），并在冰上孵育试管 30 分钟。蛋白质沉淀将使溶液从透明变为不透明。如果 30 分钟后仍未出现这种情况，请将试管冷藏 1 小时。这是一个潜在的终止点，如果需要，样品可以在 4 °C 下储存过夜><。 注意: 三氯乙酸具有腐蚀性。处理时请戴手套，防止与皮肤接触，避免吸入。
   3. 在 4 °C 下以 13,000 x g 的离心速度离心样品 10 分钟。使用连接到细玻璃微量移液器吸头的真空管路吸出 TCA 上清液，小心地去除 TCA 上清液（样品中可使用相同的吸头）。避免重吸并在移液器吸头和沉淀之间保持适当的距离，不要干扰蛋白质沉淀。
   4. 用 100 μL -20 °C 丙酮快速洗涤沉淀。此步骤会从沉淀中去除任何残留的 TCA，这可能会干扰随后的 Bradford 测定;但是，如果接触时间过长，丙酮会开始溶解蛋白质沉淀，因此应添加丙酮，然后在 5 秒内快速从沉淀中提取。
   5. 将试管放入通风橱或冰箱中，让丙酮蒸发。然后，通过向每个试管中加入 1 mL 0.1 M NaOH 来溶解蛋白质沉淀。完全溶解沉淀可能需要在热水浴中加热几轮、涡旋和超声处理><。 注意:试管在通风橱或冰箱中放置的时间越长，颗粒越干燥，它们就越难重新溶解。建议将沉淀干燥 30 分钟，然后每 10-15 分钟检查一次丙酮是否存在，直到明确丙酮已蒸发（未检测到丙酮烟雾）。
4. 混合标准溶液，稀释未知样品溶液，并使用 Bradford 分析定量未知样品的总蛋白质含量。
   1. 根据表 1 中列出的浓度制备牛免疫球蛋白 G （IgG） 标准溶液（冻干或 IgG 储备液可与去离子水混合以达到每种浓度）。将标准品储存在 4 °C。在 96 孔板中，从孔板的 A1 位置开始，一式三份添加 160 μL 每种 IgG 标准溶液（A1、A2、A3 位置 0 μg/μL，B1、B2、B3 位置 0.0125 μg/μL 等）。
   2. 向 950 μL 蒸馏水中加入 50 μL 0.1 M NaOH 来制备稀释的 NaOH 溶液。作为空白阴性对照，将 60 μL 此溶液一式三份（G1、G2、G3 位置）添加到孔板中。
   在
   3. 新的 1.5 mL 微量离心管中，将 50 μL 每种样品溶液添加到 950 μL 蒸馏水中，制备未知样品的稀释液。然后，从 H1 位置开始，将 60 μL 每种稀释样品一式三份添加到孔板中。一式三份读样时，96 孔板应可分析 6 个标准品、1 个空白样品和 25 个未知样品。分析的每个孔板应包含自己的 IgG 标准品和空白样品。
   4. 向所有空白和未知样品孔中加入 100 μL 蒸馏水。现在每个孔应总共含有 160 μL。使用多通道移液器（8 个通道），向孔板第一列的每个孔中加入 40 μL 考马斯亮蓝 G-250 蛋白染料。将染料与样品混合，浸入数次。对所有其他色谱柱重复上述步骤，更换移液器吸头以避免污染。
      注意:考马斯亮蓝 G-250 具有刺激性，应避免与皮肤、眼睛或肺部接触。请戴手套，防止与皮肤接触。如果与皮肤接触，本品会染色。
   5. 用针头戳破孔中存在的任何气泡，因为它们可能会干扰微孔板分光光度计的读数。清洁针头以避免孔之间的污染。让微孔板在室温下孵育 5 分钟。
   6. 使用微孔板分光光度计，记录每个孔在 595 nm 处的吸光度值。

表 1.可溶性蛋白质测定的标准曲线计算。计算每种标准品中蛋白质的量方法是将每种标准品的浓度乘以每孔中的标准溶液量 （160 μL）。