植物组织中可溶性蛋白含量的可溶性蛋白测定

摘要

来源：Deans, C. A. 等。利用玉米（Zea mays）作为示例定量测定植物可溶性蛋白质和可消化碳水化合物含量。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了一种比色法，用于定量植物组织中的可溶性蛋白质含量。该方法利用考马斯亮蓝 G-250 染料，该染料与可溶性蛋白质相互作用，形成蓝色稳定的蛋白质-染料复合物，其颜色深浅与组织中可溶性蛋白质含量成正比。

方案

1. 植物采集与处理

1. 采集并处理植物样品
   1. 采集植物样品后，使用镊子将植物材料浸入液氮中进行速冻，并于 -80 °C 保存。若采集的植物样品过大而无法进行速冻，可先用干冰快速冷却，并尽快转移至 -80 °C 冰箱中。植物组织脱离植株后，其大量营养元素含量可能发生改变，因此采集后应尽快冷冻样品。
      注意：液氮接触皮肤可导致严重冻伤。请务必使用经批准的容器运输液氮，并在操作时穿戴适当的个人防护装备，包括低温手套、护目镜、面罩、围裙和实验服。
   2. 使用冷冻干燥机对植物材料进行冻干，以确保在去除水分的过程中组织处于代谢失活状态。持续干燥直至样品质量稳定，以确保完全去除水分。
   3. 样品干燥后，使用研磨机或研磨仪研磨成细粉。将样品储存于干燥柜中，直至进行分析。

2. 可溶性蛋白质测定

1. 样品制备
   1. 称取每种组织的重复样品各约 20 mg，分别放入 1.5 mL 聚苯乙烯微量离心管中，并标记管子。这些样品后续将被称为未知样品。记录每个样品的精确质量，因为该信息将用于计算每个未知样品中的可溶性蛋白百分比。请使用带锁紧盖的微量离心管，因为非锁紧盖可能在后续加热步骤中打开，导致样品溶液丢失。
2. 溶解并分离未知样品中的蛋白质
   1. 使用微量移液器，向每根管中加入 500 µL 的 0.1 M NaOH。盖紧管盖，并超声处理 30 分钟。预热 90 °C 的水浴锅。
      注意：氢氧化钠为强碱，接触皮肤可引起灼伤。尽管 0.1 M NaOH 浓度较低，但仍需佩戴防护手套以避免皮肤刺激。
   2. 将离心管置于水浴锅中的试管架上，加热 15 分钟。
   3. 在 15,000 × g 条件下离心 10 分钟。使用新的移液枪头，将上清液转移至新标记的微量离心管中。向含有沉淀的管中加入 300 µL 的 0.1 M NaOH，再次在 15,000 × g 条件下离心 10 分钟。再次收集上清液，并与同一样品的前次上清液合并。此步骤可作为暂停点，如需过夜，样品可在 4 °C 下保存。
3. 沉淀植物蛋白
   1. 通过加入 11 µL 的 5.8 M HCl 中和上清液的 pH 值。将石蕊试纸浸入各样品溶液中，确认 pH 值约为 7。
      注意：盐酸为强腐蚀性酸，接触皮肤（或吸入）可引起灼伤。操作 HCl 时请佩戴手套，防止皮肤刺激。
   2. 向每根管中加入 90 µL 的 100% 三氯乙酸（TCA），并将管子置于冰上孵育 30 分钟。蛋白质沉淀会使溶液由澄清变为浑浊。若 30 分钟后未出现浑浊，可将管子冷藏 1 小时。此步骤可作为暂停点，如需过夜，样品可在 4 °C 下保存。
      注意：三氯乙酸具有腐蚀性。操作时请佩戴手套，避免接触皮肤及吸入蒸气。
   3. 在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 10 分钟。使用连接真空泵的细玻璃微量移液枪头小心吸除 TCA 上清液（可在不同样品间重复使用同一枪头）。避免强烈抽吸或使移液枪头过于接近沉淀，以免扰动蛋白沉淀。
   4. 用 100 µL 的 -20 °C 丙酮快速洗涤沉淀。此步骤可去除沉淀中残留的 TCA，防止其干扰后续 Bradford 测定；但若丙酮与沉淀接触时间过长，会开始溶解蛋白沉淀，因此丙酮加入后应在 5 秒内迅速吸出。
   5. 将管子置于通风橱或冰箱中，使丙酮挥发。然后向每根管中加入 1 mL 的 0.1 M NaOH 以溶解蛋白沉淀。完全溶解沉淀可能需要多次在热水浴中加热、涡旋振荡及超声处理。
      注意：管子在通风橱或冰箱中放置时间越长，沉淀越干燥，重新溶解将越困难。建议干燥 30 分钟后，每隔 10–15 分钟检查一次丙酮残留情况，直至确认丙酮已完全挥发（无丙酮气味）。
4. 配制标准溶液，稀释未知样品溶液，并使用 Bradford 法测定未知样品的总蛋白含量。
   1. 根据表 1所列浓度配制牛免疫球蛋白 G（IgG）标准溶液（可将冻干粉或 IgG 储备液与去离子水混合以获得各浓度）。将标准品储存在 4 °C。在 96 孔板中，从 A1 孔开始，每种 IgG 标准溶液各加 160 µL，每种设三个复孔（A1、A2、A3 孔为 0 µg/µL，B1、B2、B3 孔为 0.0125 µg/µL，依此类推）。
   2. 将 50 µL 的 0.1 M NaOH 加入 950 µL 蒸馏水中，配制稀释的 NaOH 溶液。作为空白阴性对照，将该溶液以三个复孔形式各加 60 µL 至 96 孔板中（G1、G2、G3 孔）。
   3. 在新的 1.5 mL 微量离心管中，将每份样品溶液 50 µL 加入 950 µL 蒸馏水中，制备未知样品的稀释液。然后从 H1 孔开始，将每种稀释后的样品以三个复孔形式各加 60 µL 至 96 孔板中。当所有样品均设三个复孔时，一块 96 孔板可容纳 6 个标准品、1 个空白对照和 25 个未知样品。每块待测孔板均应包含其自身的 IgG 标准品和空白对照样品。
   4. 向所有空白和未知样品孔中加入 100 µL 蒸馏水。此时每孔总体积应为 160 µL。使用多通道移液器（8 通道），向孔板第一列的每个孔中加入 40 µL 考马斯亮蓝 G-250 蛋白染料。通过反复吹打使染料与样品充分混匀。对其他各列重复此操作，每次更换移液枪头以避免交叉污染。
      注意：考马斯亮蓝 G-250 具有刺激性，应避免接触皮肤、眼睛或肺部。请佩戴手套防止皮肤接触。若接触皮肤，该产品会造成染色。
   5. 使用针头刺破孔中可能出现的气泡，以免干扰酶标仪读数。清洁针头以避免孔间污染。让孔板在室温下孵育 5 分钟。
   6. 使用酶标仪在 595 nm 波长下记录每个孔的吸光度值。

表1. 可溶性蛋白测定的标准曲线计算。 每个标准品中的蛋白量通过将各标准品的浓度乘以每孔中标准品溶液的体积（160 µL）来计算。

IgG 浓度 (μg/μL)	标准样品中的蛋白含量 (μg)
0.0000	0
0.0125	2
0.0250	4
0.0375	6
0.0500	8
0.1000	16

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酶标仪（分光光度计）	Bio-Rad	Model 680 XR
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液	Bio-Rad	#5000006	450 mL