用于定量植物组织中非结构性碳水化合物的比色测定

1. 植物采集和加工

1. 收集植物样品后，用镊子将植物材料浸入液氮中，快速冷冻样品，并储存在-80°C。如果收集的植物样品太大而无法快速冷冻，请使用干冰快速冷却样品并尽快转移到 -80 °C 冰箱中。组织与植物分离后，植物材料的常量营养素含量会发生变化，因此在采集后尽快冷冻植物样品很重要><。 谨慎:液氮与皮肤接触会导致严重的冻伤。请确保将液氮放在经批准的容器中运输，并在处理液氮时穿戴适当的个人防护装备，包括冷冻手套、护目镜、面罩、围裙和实验服。
2. 使用冷冻干燥机冻干植物材料，以确保在去除水分时组织代谢失活。干燥直至样品质量稳定，以确保去除所有水分。
3. 样品干燥后，使用研磨机或研磨机研磨成细粉。将样品储存在干燥柜中直至分析。

2. 可消化碳水化合物测定

1. 样品制备
   1. 称取每个组织的重复样品，每个样品约 20 mg，放入带有橡胶衬里螺帽（100 mm 长度）的 15 mL 玻璃管中。这些样本随后将被称为未知样本。用防水记号笔或盖子上的标签胶带标记试管，并记录每个样品的确切质量，因为计算每个未知样品中的碳水化合物百分比需要此信息。
2. 从每个未知样品中提取可消化的碳水化合物。
   1. 向每根试管中加入 1 mL 的 0.1 M H₂SO₄，并将盖子拧紧到试管上。放入沸水浴中 1 小时。
      谨慎: 硫酸具有很强的腐蚀性。处理 H₂SO₄ 时，请戴上手套、护目镜和围裙，并在通风橱中执行此步骤。
   2. 在温水浴中冷却试管。将管内容物倒入标记的 1.5 mL 微量离心管中（如果玻璃管中残留一些植物材料，请不要担心）。
   以
   3. 15,000 x g 离心管 10 分钟。用微量移液器去除上清液，并放入新标记的 1.5 mL 微量离心管中。此时，试管可以冷藏过夜。如果继续进行测定，请参阅步骤 2.3.2。
3. 混合标准溶液并定量未知样品的总可消化碳水化合物含量。
   1. 制备浓度如表 1 所示的 D（+） 葡萄糖标准溶液。准备六个玻璃试管，每种标准溶液 400 μL。
   将
   2. 每个未知样品的 15 μL 移液到其自己的试管中，并向每个样品中加入 385 μL 蒸馏水，每个试管中的总体积为 400 μL。在通风橱中，向每个标准和未知样品试管中加入 400 μL 5% 苯酚，然后快速将 2 mL 浓 H₂SO₄ 移液到每个试管中。不要用移液器吸头接触试管内容物，只需添加到溶液表面即可（连续移液管最适合此）。
   3. 让试管孵育 10 分钟，然后小心地涡旋试管以混合内容物。再孵育 30 分钟。
      谨慎:苯酚和硫酸是腐蚀性刺激物。为避免接触皮肤、眼睛和吸入，应在化学通风橱中使用适当的个人防护装备进行此步骤，其中包括:面罩或护目镜、橡胶手套、实验室围裙和靴子。苯酚与硫酸混合也会导致放热反应，这将导致管子变热。
   将
   4. 每管中的 800 μL 样品移液到 3 个聚苯乙烯 1.5 mL 半微量比色皿中（每个样品 3 个技术重复）。将分光光度计设置为在 490 nm 处读数。在读取标准品或未知样品之前，在含有蒸馏水的空白比色皿上校准，并在样品读数过程中间歇性地校准。通过分光光度计运行每个比色皿并记录吸光度。每个未知样本的技术仿行平均值。
      注意:在某些情况下，样品可能会超过吸光度上限阈值。如果是这样，则应在步骤 1.3.1 中稀释样品。在后续计算中也必须考虑稀释度。
   5. 计算每个标准品的平均吸光度。
      注意:要使用标准曲线计算每个未知样品中存在的总可消化碳水化合物的量，最简单的方法是将每个标准品的平均吸光度与每个标准品中存在的微克 D（+）葡萄糖进行回归，但如果需要，也可以绘制每个标准品的 D（+）葡萄糖浓度 （μg/μL）。然而，以下计算是指基于微克级的标准曲线，而不是浓度 （μg/μL）。
   6. 通过绘制每种标准溶液中 D（+）葡萄糖总量 （μg） 的平均吸光度来计算标准曲线。对这些数据拟合线性回归线，然后使用以下方程计算每个未知样品中的碳水化合物总量 （μg）:
      M_c = （（（（A_x – b）/m）/（15））*1000
      M_c = 样品中碳水化合物的 μg
      A_x = 未知样品的平均吸光度
      b = y 截距（标准回归线）
      m = 斜率（标准回归线）
      这条线的相关系数应大于 0.98，通常接近 0.99。然后，使用以下公式确定每个样品中碳水化合物的百分比:
      P_c = （（M_c/1000）/（M_i））*100
      P_c =%碳水化合物
      M_i = 样品的初始质量 （mg）

表 1.可消化碳水化合物测定的标准曲线计算。计算每种标准品中葡萄糖的量方法是将每种标准品的浓度乘以每根试管中的标准溶液量 （400 μL）