植物组织中非结构性碳水化合物的比色定量测定

摘要

来源：Deans, C. A. 等. 以玉米（Zea mays）为例定量测定植物可溶性蛋白质和可消化碳水化合物含量. J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了定量测定植物组织中可消化碳水化合物的方法。该方法有助于从多种植物组织中收集数据，以研究营养生态学、植物与草食动物的相互作用以及食物网动态。

方案

1. 植物采集与处理

1. 采集植物样品后，使用镊子将植物材料浸入液氮中进行速冻，并在 -80 °C 下保存。如果采集的植物样品过大而无法进行速冻，应使用干冰快速冷却，并尽快转移至 -80 °C 冰箱中。植物组织从植株分离后，其大量营养元素含量可能发生改变，因此在采集后应尽快冷冻样品。
   注意：液氮接触皮肤可导致严重冻伤。请确保使用经批准的容器运输液氮，并在操作时穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括低温手套、护目镜、面罩、围裙和实验服。
2. 使用冷冻干燥机对植物材料进行冻干，以确保在去除水分的过程中组织处于代谢失活状态。持续干燥直至样品质量稳定，以确保所有水分已被完全去除。
3. 样品干燥后，使用研磨机或研磨仪将其研磨成细粉。将样品存放在干燥柜中，直至进行分析。

2. 可消化碳水化合物检测

1. 样品制备
   1. 将每种组织样品分别称取约 20 mg 的重复样品，放入带有橡胶衬里螺旋盖的 15 mL 玻璃试管中（长度 100 mm）。这些样品后续将被称为未知样品。使用防水记号笔或在管盖上贴标签胶带进行标记，并记录每个样品的精确质量，因为该信息将用于计算每个未知样品中的碳水化合物百分比。
2. 从每个未知样品中提取可消化碳水化合物。
   1. 向每个试管中加入 1 mL 的 0.1 M H₂SO₄，并拧紧管盖。将试管置于沸水浴中加热 1 小时。
      注意：硫酸具有强腐蚀性。操作 H₂SO₄ 时请佩戴手套、护目镜和实验服，并在通风橱中进行此步骤。
   2. 将试管在温水浴中冷却。将试管内容物倒入已标记的 1.5 mL 微离心管中（若部分植物材料残留在玻璃试管中，无需担心）。
   3. 以 15,000 × g 离心 10 分钟。用微量移液器移除上清液，并转移至新的已标记 1.5 mL 微离心管中。此时可将样品在冰箱中冷藏过夜。若继续进行检测，请参见步骤 2.3.2。
3. 配制标准溶液并测定未知样品中总可消化碳水化合物含量。
   1. 根据表 1列出的浓度配制 D(+)葡萄糖标准溶液。准备六支玻璃试管，每支加入 400 µL 的各标准溶液。
   2. 将每种未知样品各取 15 µL 加入各自的试管中，并向每支试管中加入 385 µL 蒸馏水，使每支试管总体积为 400 µL。在通风橱中，向每支标准品和未知样品试管中加入 400 µL 的 5% 苯酚溶液，然后迅速向每支试管中加入 2 mL 浓 H₂SO₄。移液枪头不要接触试管内液体，只需将试剂加至液面表面（使用多通道移液器效果最佳）。
   3. 让试管静置孵育 10 分钟，然后小心地涡旋混匀。继续孵育 30 分钟。
      注意：苯酚和硫酸均为腐蚀性刺激物。为防止皮肤、眼睛接触及吸入，此步骤应在化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括面罩或护目镜、橡胶手套、实验服和靴子。苯酚与硫酸混合会产生放热反应，导致试管变热。
   4. 从每支试管中吸取 800 µL 样品，分别加入 3 个聚苯乙烯 1.5 mL 半微量比色皿中（每个样品设 3 个技术重复）。将分光光度计设置为 490 nm 波长读数。在测定标准品或未知样品前，使用含蒸馏水的空白比色皿校准仪器，并在样品测定过程中间歇性重新校准。将每个比色皿依次放入分光光度计中测定吸光度，并记录数据。对每个未知样品的技术重复结果取平均值。
      注意：在某些情况下，样品的吸光度可能超过仪器上限。若出现此情况，应在步骤 1.3.1 中对样品进行稀释。后续计算中必须考虑稀释倍数。
   5. 计算每个标准品的平均吸光度。
      注意：为利用标准曲线计算每个未知样品中总可消化碳水化合物的含量，最简便的方法是将每个标准品的平均吸光度对其所含 D(+)葡萄糖的微克数（µg）进行回归分析；但也可根据需要绘制每个标准品的 D(+)葡萄糖浓度（µg/µL）曲线。然而，以下计算均基于以微克数（而非浓度 µg/µL）为横坐标的标准曲线。
   6. 通过将每个标准溶液的平均吸光度对其中 D(+)葡萄糖的总含量（µg）作图，绘制标准曲线。对这些数据拟合线性回归直线，然后使用以下公式计算每个未知样品中碳水化合物的总量（µg）：
      M_c = (((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = 样品中碳水化合物的微克数
      A_x = 未知样品的平均吸光度
      b = 截距（标准回归线）
      m = 斜率（标准回归线）
      该回归线的相关系数应大于 0.98，通常接近 0.99。然后使用以下公式计算每个样品中碳水化合物的百分比：
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c = 碳水化合物百分比
      M_i = 样品初始质量（mg）

表1. 可消化碳水化合物测定的标准曲线计算。通过将每个标准品的浓度乘以每个试管中标准品溶液的体积（400 µL），计算出每个标准品中葡萄糖的含量

D(+)葡萄糖浓度 (ug/μL)	标准样品中 D(+)葡萄糖含量 (ug)
0.0000	0
0.0375	15
0.0750	30
0.1125	45
0.1500	60
0.1875	75

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酶标仪（分光光度计）	Bio-Rad 型号	680 XR