基于荧光素酶的生长检测法定量测定胞内寄生虫繁殖

摘要

来源：Key, M.，等，利用基于荧光素酶的生长检测法测定化学抑制剂对细胞内Toxoplasma gondii生长的抑制效率。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了利用荧光素酶检测法来定量细胞内寄生虫Toxoplasma gondii的生长。通过使用一种在感染宿主细胞后可表达荧光素酶的Toxoplasma菌株，可在感染的细胞培养物中检测荧光素酶活性，从而判断寄生虫是否成功增殖。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 基于荧光素酶的Toxoplasma生长检测

1. 在接种寄生虫前 1 周接种人包皮成纤维细胞（HFFs），以确保宿主细胞完全汇合。在透明板中进行模拟实验，以确保在整个评估期间寄生虫保持在细胞内。
   注意： 此处实验在 96 孔微孔板中进行。根据实验需要，可扩展至 384 或 1536 孔微孔板。
2. 在使用前 2 天，将Toxoplasma寄生虫传代至汇合的 HFFs 中，方法是将约 0.3–0.4 mL 完全裂解的寄生虫转移至 T25 培养瓶中。将感染的宿主细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 天。
3. 将 5 mL 新鲜裂解的寄生虫通过 21 G 安全针反复抽打 5 次以释放胞内寄生虫，然后通过 3 µm 滤膜去除宿主细胞碎片。用 7 mL 无酚红 D10 培养基冲洗培养瓶中残留的寄生虫，再次通过滤膜过滤。
4. 在室温（RT）下以 1000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 10 mL 无酚红 D10 培养基中。
5. 使用血细胞计数板计数寄生虫，以确定其浓度。
6. 将野生型（WT）菌株的寄生虫稀释至 1 × 10⁴ 个/mL。对于生长缺陷型寄生虫菌株，应相应提高浓度，以便观察到显著增强的荧光素酶信号。
7. 小心吸除预先接种 HFFs 的 96 孔微孔板中的培养基，每孔加入 150 µL 寄生虫重悬液，按三列五排的方式接种，代表三个技术重复和五个时间点。
8. 将微孔板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 4 小时。
9. 小心吸除各孔中的培养基以去除未入侵的寄生虫，然后用室温无酚红培养基补满每一行的孔（第一行除外）。
10. 将 PBS 与 2× 荧光素酶检测缓冲液等体积混合，并将荧光素酶底物稀释至 12.5 µM。
11. 向最上面一行的每个孔中加入 100 µL 稀释后的荧光素酶底物。将微孔板在室温下孵育 10 分钟，使细胞充分裂解。
12. 使用微孔板读数仪检测荧光素酶活性。仪器设置见表 1。每次读数代表感染后 4 小时时已入侵寄生虫的初始数量。
13. 在 4 天内每隔 24 小时重复步骤 1.9–1.12，每次处理一行，期间不更换培养基。这些读数分别反映感染后 24 小时、48 小时、72 小时和 96 小时时寄生虫的总复制数量。
14. 计算每个时间点的平均读数，并将其除以感染后 4 小时的平均读数，以确定寄生虫随时间增长的倍数变化。
15. 使用绘图软件绘制数据。
16. 为计算倍增时间，将各时间点的倍数变化的 log2 值对孵育时间作图。使用线性回归函数计算斜率，该斜率代表各菌株的倍增时间。

表1： 基于荧光素酶的荧光素酶活性检测微孔板读数仪设置 弓形虫 生长实验

荧光素酶：	终点检测
积分时间：	1 s
滤光片组 - 发射光：	全光谱
光学路径：	顶部读数
增益：	135
读数速度：	正常
延迟时间：	100 ms
读数高度：	4.5 mm

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biotek Synergy H1 多功能微孔板读板机	BioTek 仪器
腔肠素 h	Prolume	301-10 hCTZ
<强>软件
GraphPad Prism 软件（第8版） 版本