荧光素酶检测法用于研究抗寄生虫化学药物对寄生虫的药效

摘要

来源：Key, M.，等。利用基于荧光素酶的生长检测法测定化学抑制剂对细胞内Toxoplasma gondii生长的抑制效率。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了利用荧光素酶检测法评估抗寄生虫化学抑制剂对细胞内病原体 Toxoplasma gondii 抑制效果的实验过程。研究中，表达荧光素酶的寄生虫侵入宿主细胞以进行复制和存活。化学抑制剂与寄生虫的半胱氨酸蛋白酶结合，从而抑制其复制。所检测到的荧光素酶活性与寄生虫生长倍数变化成正比，据此可确定药物对寄生虫的抑制效力。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 评估化合物对Toxoplasma生长的抑制效果

注意：此处以 LHVS 对Toxoplasma生长抑制作用的评估为例。测试了八种不同浓度的 LHVS，针对 RHΔku80::NLuc 和 RHΔku80Δcpl::NLuc 两个菌株，每个生物学重复进行三次技术重复，共三个生物学重复。

1. 在寄生虫感染前，将HFF细胞接种至96孔微孔板中，每种化合物每种虫株设置一个生物学重复，接种方式为三行九列。宿主细胞需培养至少7天后方可使用。
2. 使用前2天对RHΔku80::NLuc 和 RHΔku80Δcpl::NLuc 寄生虫进行传代。
3. 使用前2天，将Toxoplasma寄生虫接种至汇合的HFF细胞中，方法是将约0.3–0.4 mL完全裂解的寄生虫转移至T25培养瓶中。将感染的宿主细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养2天。
4. 取5 mL新鲜裂解的寄生虫，用21 G安全针头抽吸5次以释放胞内寄生虫，随后通过3 µm滤膜去除宿主细胞碎片。用7 mL无酚红D10培养基冲洗培养瓶中残留的寄生虫，再次通过滤膜。
5. 在室温（RT）下以1000 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL无酚红D10培养基中。
6. 使用血细胞计数板计数寄生虫，确定其浓度。
7. 将野生型（WT）虫株的寄生虫稀释至1 × 10⁴ 个/mL。对于生长缺陷型寄生虫虫株，应相应提高浓度，以便观察到显著的荧光素酶信号增长。
8. 将寄生虫重悬于无酚红培养基中，浓度为1 × 10⁴ 个/mL。
9. 吸除含汇合HFF细胞的培养板中的培养基，每孔接种150 µL寄生虫重悬液。将微孔板在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时。
10. 在12孔储液槽中通过连续稀释法配制8种不同浓度的LHVS。通常采用三倍梯度稀释方式。
    注意：最低浓度相对于最高浓度稀释了6,561倍。可根据各化合物的不同性质相应调整稀释倍数。
11. 感染后4小时，吸除培养基以去除未侵入的寄生虫，然后向第2至第9列的每孔中加入150 µL含不同浓度LHVS的培养基。第一列保留加入常规培养基，作为未处理对照组。
12. 将微孔板在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育96小时。
13. 小心吸除各孔中的培养基以去除未侵入的寄生虫，然后向每行孔中（除第一行外）加入室温的无酚红培养基。
14. 将PBS与2×荧光素酶检测缓冲液等体积混合，并将荧光素酶底物稀释至12.5 µM。
15. 向顶行各孔中加入100 µL稀释后的荧光素酶底物。将微孔板在室温下孵育10分钟，使细胞充分裂解。
16. 测定各孔的荧光素酶活性。
17. 对每种LHVS浓度下三个技术重复孔的荧光素酶活性取平均值。
18. 将每种LHVS浓度下的平均荧光素酶活性除以未处理寄生虫组的平均荧光素酶活性，计算归一化的荧光素酶活性（以百分比表示）。
19. 使用绘图软件将归一化的荧光素酶活性与各LHVS浓度作图（图1）。同时测定乙胺嘧啶对寄生虫生长的抑制作用作为对照。乙胺嘧啶是一种临床抗生素，通过抑制Toxoplasma中的叶酸代谢来治疗急性弓形虫病。
20. 使用绘图软件中“剂量-反应-抑制”回归程序下的内建方法（归一化响应 vs. [抑制剂]）计算各化合物的IC₅₀值。IC₅₀值通过以下公式计算：
    Y = 100/(1 + X/IC₅₀)
    其中：Y表示在不同浓度抑制剂作用下感染细胞的归一化荧光素酶活性，X表示抑制剂的各个浓度。

结果

图 1:使用基于荧光素酶的生长测定法对 LHVS 和乙胺嘧啶的抑制效果评估。将寄生虫接种到 96 孔微孔板中 4 小时以允许侵袭宿主细胞。洗去未侵袭的寄生虫，用含有不同浓度 LHVS 或乙胺嘧啶的培养基填充板，并在测定荧光素酶活性之前再孵育 96 小时。用单个抑制剂浓度处理的寄生虫的测量荧光素酶读数与从未处理的寄生虫检测到的信号进行标准化。将数据绘制在绘图程序中，并进行 IC₅₀ 测定的回归分析。该测定分 3 个生物学重复，每个生物学重复 3 个技术重复。数据表示 SEM ±平均值，n = 3 次生物学重复。

材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 Biotek Synergy H1 混合型多功能微孔板检测仪 BioTek 仪器 腔肠素 h Prolume 301-10 百百基环氧试验团 软件 GraphPad Prism 软件（第 8 版）