Msp1提取实验用于研究错误定位的尾锚定蛋白的去除

摘要

来源：Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. 使用完全纯化组分重建 Msp1 提取活性。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了一种 体外 研究Msp1介导的从脂质体双层膜中清除错位整合的TA蛋白的实验方案。将Msp1与TA蛋白共同重组至脂质体中，通过亲和纯化验证ATP依赖性的TA蛋白转位过程。

方案

1. 脂质体的制备

1. 按适当比例混合脂质的氯仿贮存液，以模拟线粒体外膜。
   1. 准备25 mg脂质混合物。我们使用一种先前建立的模拟线粒体膜的脂质混合物，其摩尔比为48:28:10:10:4的鸡卵磷脂酰胆碱（PC）、鸡卵磷脂酰乙醇胺（PE）、牛肝磷脂酰肌醇（PI）、合成的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（DOPS）和合成的1',3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂]-甘油（TOCL）。样品计算如下所示 表1.
   2. 将所有脂质储备液恢复至室温后再打开，以减少冷凝。由于大多数实验室缺乏精确测定脂质浓度的方法，氯仿储备液吸收的任何水分都会改变脂质储备液的浓度，从而影响检测中所用脂质的比例。
   3. 由于脂质储存于玻璃安瓿瓶中，使用1 mL注射器将所需量的脂质转移至玻璃小瓶。向小瓶中加入2 mg二硫苏糖醇（DTT）以防止脂质氧化。操作应迅速，因为氯仿挥发会改变脂质浓度。
   4. 将剩余的脂质转移至一个单独的玻璃小瓶中，并配以聚四氟乙烯（PFTE）垫片密封。向小瓶中加入2 mg DTT，用Parafilm封口膜包裹，于-20 °C保存以防止脂质氧化。建议在脂质转移至小瓶后的3个月内使用完毕。为避免记号笔墨水污染氯仿储存液，应将原始安瓿上的标签贴纸转移至玻璃小瓶，而非使用记号笔直接标记。
2. 在通风橱中，用手持续旋转玻璃小瓶，同时用极微弱的氮气流吹扫....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物珠	Bio-Rad	 1523920
牛肝磷脂酰肌醇	Avanti	 840042C	 PI
鸡卵磷脂酰胆碱	Avanti	 840051C	 PC
鸡卵磷脂酰乙醇胺	Avanti	 840021C	 PE
滤膜支撑板	Avanti	 610014
玻璃小瓶	VWR	 60910L-1
谷胱甘肽自旋柱	Thermo Fisher	 PI16103
微型挤出器	Avanti	 610020
合成 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸	Avanti	 840035C	 DOPS
合成 1',3'-双[12-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂]-甘油	Avanti	 710335C	 TOCL
1 mL 注射器	Norm-Ject 53548-001
1 mL 注射器  气密型 	Avanti 610017