来源：Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. 使用完全纯化组分重建 Msp1 提取活性。J. Vis. Exp. (2021)。
本视频演示了一种 体外 研究Msp1介导的从脂质体双层膜中清除错位整合的TA蛋白的实验方案。将Msp1与TA蛋白共同重组至脂质体中，通过亲和纯化验证ATP依赖性的TA蛋白转位过程。
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方法文章
Msp1提取实验用于研究错误定位的尾锚定蛋白的去除
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 脂质体的制备
- 按适当比例混合脂质的氯仿贮存液，以模拟线粒体外膜。
- 准备25 mg脂质混合物。我们使用一种先前建立的模拟线粒体膜的脂质混合物，其摩尔比为48:28:10:10:4的鸡卵磷脂酰胆碱（PC）、鸡卵磷脂酰乙醇胺（PE）、牛肝磷脂酰肌醇（PI）、合成的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（DOPS）和合成的1',3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂]-甘油（TOCL）。样品计算如下所示 表1.
- 将所有脂质储备液恢复至室温后再打开，以减少冷凝。由于大多数实验室缺乏精确测定脂质浓度的方法，氯仿储备液吸收的任何水分都会改变脂质储备液的浓度，从而影响检测中所用脂质的比例。
- 由于脂质储存于玻璃安瓿瓶中，使用1 mL注射器将所需量的脂质转移至玻璃小瓶。向小瓶中加入2 mg二硫苏糖醇（DTT）以防止脂质氧化。操作应迅速，因为氯仿挥发会改变脂质浓度。
- 将剩余的脂质转移至一个单独的玻璃小瓶中，并配以聚四氟乙烯（PFTE）垫片密封。向小瓶中加入2 mg DTT，用Parafilm封口膜包裹，于-20 °C保存以防止脂质氧化。建议在脂质转移至小瓶后的3个月内使用完毕。为避免记号笔墨水污染氯仿储存液，应将原始安瓿上的标签贴纸转移至玻璃小瓶，而非使用记号笔直接标记。
- 在通风橱中，用手持续旋转玻璃小瓶，同时用极微弱的氮气流吹扫，蒸发氯仿，相当于手动旋转蒸发。用手以稳定的速度（20–40 rpm）旋转小瓶，使脂质保持流动。目标是完全蒸发掉氯仿，并在玻璃小瓶内壁形成均匀的脂质薄膜。
警告： 氯仿具有神经毒性，此步骤应在通风橱中进行。- 将一支新的巴斯德吸管连接到氮气管上。操作时避免脂质溅出小瓶或沾到巴斯德吸管上。将吸管尖端对准小瓶底部，使气流从底部反弹，推动脂质向上并集中至小瓶中央。在整个小瓶内壁形成均匀涂层，同时避免在瓶角或瓶盖附近出现积聚。整个过程约需5分钟。
- 当混合物浓缩形成脂质“小球”时，通过调整小瓶的角度将其引导至小瓶中心。当小球开始缩小后，略微加大氮气流以分散小球，确保脂质不会被吹出小瓶。
- 在真空条件下除去残留的氯仿。
- 将玻璃小瓶置于家用真空泵或隔膜真空泵中抽气1小时，以去除大部分残留的氯仿。这类真空泵的抽力通常不足以完全除去所有氯仿，但相比旋转叶片式真空泵，其对少量溶剂的耐受性更好。
- 将小瓶置于强真空环境中（<1 mTorr）下持续12–16小时以去除所有残留的氯仿。在此过程中务必避免小瓶发生暴沸。
- 将脂质重悬于1.25 mL脂质体缓冲液（50 mM HEPES KOH pH 7.5，15%甘油，1 mM DTT）中。由于起始脂质用量为25 mg，所得浓度为20 mg/mL。确保脂质完全重悬，无可见颗粒。若脂质聚集在离心管角落，则可能需要较长时间完成重悬。
- 剧烈涡旋小瓶，直至样品呈均匀乳状。我们发现，如果前一晚氯仿蒸发步骤操作得当，此过程大约需要5-10分钟。
- 为确保脂质完全重悬，将样品瓶置于室温下以约80 rpm的速度在旋转轮上旋转3小时。每隔1小时从旋转轮上取下样品瓶，涡旋振荡1分钟，以确保混合均匀。
- 将脂质小心转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。使用液氮冷冻和30 °C金属浴解冻，进行5次冻融循环。此步骤有助于将多层囊泡转化为单层囊泡。
- 挤出脂质。
- 在冻融循环过程中，准备微型挤出器。将微型挤出器装配10 mm的滤膜支撑片和所需孔径的聚碳酸酯膜（我们使用200 nm）。滤膜的尺寸会影响脂质体的大小，进而影响重组所需蛋白的浓度步骤 2.3).
- 将微型挤出机置于加热板上，将挤出机温度升至 60 °C。
- 将脂质吸入1 mL气密玻璃注射器中，小心地插入微型挤出器的一端。将空的气密注射器插入微型挤出器的另一端。让脂质在挤出器支架温度下平衡5–10分钟。
- 将装有脂质的注射器中的溶液通过轻推活塞转移至另一支注射器中。再将溶液从另一支注射器推回原始注射器。重复此来回操作共15次，使第15次结束时th 将脂质末端通过另一注射器。每次推注时监测体积，确保无泄漏。
- 制备脂质的单次使用分装液，液氮速冻后于 -80 °C 保存。脂质体在 -80 °C 下可稳定保存数月。每次重组反应需使用 10 μL 脂质体步骤 2.3.4因此，制备10 μL或20 μL的分装样品较为方便。
2. Msp1 与模型 TA 蛋白的重建
- 配制复性缓冲液：50 mM HEPES（pH 7.5）、200 mM 醋酸钾、7 mM 醋酸镁、2 mM DTT、10% 蔗糖、0.01% 叠氮化钠、0.2–0.8% 脱氧胆酸大皂苷（DBC）。
- 优化新批次脂质体的重建条件。用于最佳重建的DBC和生物珠（biobeads）所需浓度取决于所用脂质体的批次。为减少不同制备批次间的差异，所有实验应使用同一批次的DBC。更换DBC批次时，需重复优化过程。
- 每次制备新的脂质体批次时，设置一系列不同浓度的去氧胆酸钠（DBC，0.2%–0.8%）和生物珠（biobeads，25 mg–100 mg）的重建实验。需注意避免将DBC浓度降至其临界胶束浓度（CMC）以下（约0.12%）。一旦确定最佳条件，建议在后续所有实验中采用相同的脂质体制备及重建条件。
- 通过使用文中所述的提取实验，评估不同重建条件的有效性 步骤 3.
- 制备终浓度为250 mg/mL的Bio-Beads。
- 称取2.7 g干燥的Bio-Beads，加入约45 mL 100%甲醇，于50 mL离心管中重悬，以润湿珠粒。初始润湿步骤需使用甲醇，防止空气滞留在珠粒孔隙中。一旦置于甲醇中，须始终保持Bio-Beads湿润，因任何被珠粒截留的空气均会影响其吸收去垢剂的能力。
- 用约 45 mL 超纯水（18.2 mΩ）洗涤珠子 8 次以去除甲醇，此后简称 ddH₂O2O. 在3,200 × g离心1分钟使胶珠成团。弃去上清液，将胶珠重悬于ddH₂O中。2O.
- 洗涤后，在 10 ml ddH₂O 中重悬2加入0.02%叠氮化钠，并于4 °C保存。Biobeads可在4 °C下保存数月。该储备液浓度为250 mg/mL，因洗涤步骤中损失约0.2 g，故按此计算。
- 计算脂质体的大小以及每个脂质体中TA蛋白和Msp1蛋白所需的分子数量。这将决定重组过程中所需的Msp1和TA蛋白浓度。
- 首先，计算每个单层脂质体中的脂质分子数量（N总计）使用以下公式
其中 d 是脂质体的直径， h 是双层膜的厚度，且 a 是脂质头部基团的面积。- 通过动态光散射法（DLS）测量脂质体直径。在本示例中，脂质体直径为70 nmd) 获得。
- 将 h 的值设为 5 nm，0.71 nm2 用于 a，即磷脂酰胆碱的头部基团大小。在此特定情况下， N总计 是 37,610。
- 接下来，计算脂质的摩尔浓度 M脂质 使用混合脂质的平均分子量。在此示例中，脂质的浓度为 20 mg/mL（步骤 1.4）且脂质的平均分子量为 810 g/mol（表1）。这得到一个 0.0247 M 的值 M脂质.
- 接下来，计算脂质体的摩尔浓度， M脂质体，使用以下公式
其中 M脂质 脂质的摩尔浓度 步骤 2.3.2，以及 N总计 是根据脂质体中脂质总数计算的 步骤 2.3.1在此示例中，脂质体的20 mg/mL储备浓度约为660 nM。 - 计算100 μL重建反应所需的Msp1和TA蛋白的量。
注意： 重组体系中脂质的最终浓度为 2 mg/mL，相当于脂质体储备液的 10 倍稀释，所得脂质体终浓度为 66 nM。Msp1 的最终浓度为 792 nM，平均每脂质体含有 12 个 Msp1 分子（2 个功能性六聚体）。TA 蛋白的最终浓度为 660 nM，平均每脂质体含有 10 个 TA 蛋白分子。
- 首先，计算每个单层脂质体中的脂质分子数量（N总计）使用以下公式
- 在PCR管中，将纯化的Msp1、TA蛋白和脂质体加入重构缓冲液中混合。添加顺序为缓冲液、蛋白质，最后加入脂质体。总体积为100 μL。将混合物置于冰上静置10分钟。纯化Msp1和TA蛋白。
- 首次建立该检测方法时，使用经过充分表征的模型TA蛋白His-Flag-Sumo-Sec22作为阳性对照底物。该构建体含有His标签，便于纯化；3×Flag标签，可用于Western blot检测；Sumo结构域，可提高可溶性；以及内质网定位TA蛋白Sec22的跨膜结构域（TMD），可用于Msp1介导的重组与识别。
- 确保Msp1和TA蛋白的储存液浓度均约为100 μM，以尽量减少蛋白纯化过程中使用的N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）对重组反应的影响。纯化的Msp1蛋白储存于含20 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM氯化钠、0.1 mM三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）、0.05% DDM的缓冲液中，而纯化的TA蛋白储存于含50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM氯化钠、10 mM氯化镁、5 mM β-巯基乙醇、10%甘油、0.1% DDM的缓冲液中。约100 μM的TA蛋白和Msp1单体储存液可确保这些组分在重组体系中所占比例适宜 < 最终重悬体积的5%，使DDM的稀释浓度低于其临界胶束浓度（CMC）。
- 向样品中加入适量的生物珠以去除去垢剂。
- 将 p200 移液枪枪头的尖端剪去约 1/8th 直径为1英寸，以便珠子能够通过尖端。充分涡旋混匀生物珠管，以获得均匀的混合物，并在生物珠沉降前迅速打开管盖并移取所需体积。将生物珠转移至一个空的PCR管中。
- 当重悬液在冰上完成10分钟孵育后，使用未剪切的移液枪头将生物珠中的所有液体吸出。随后将100 μL重悬液转移至含有生物珠的离心管中。此操作必须迅速完成，以防止生物珠截留空气导致珠子上浮。
- 在 4 °C 条件下，以约 80 rpm 的速度在旋转轮上旋转复溶 16 小时。
- 从生物珠中移除重悬的样品。使用微型离心机短暂离心，使生物珠形成沉淀，然后用未剪切的移液枪头将重悬的样品转移至新的洁净PCR管中。重复此步骤1-2次，直至样品中无残留生物珠。重悬过程需保持在冰上进行。
- 预清除重组材料，以去除未能成功重组入脂质体的蛋白质。
- 制备提取缓冲液：50 mM HEPES（pH 7.5）、200 mM 醋酸钾、7 mM 醋酸镁、2 mM DTT、100 nM 氯化钙。
- 根据制造商的说明，用裂解缓冲液平衡谷胱甘肽自旋柱。通常包括用400 μL缓冲液洗涤3次，每次在700 x g下离心 g 室温下孵育2分钟以去除缓冲液。
- 向重建的材料中加入每种分子伴侣各5 μM（GST-SGTA和GST-钙调蛋白）。这些分子伴侣将结合到未能成功插入脂质体中的跨膜结构域（TMD）蛋白上。分子伴侣的纯化方法此前已有描述。
注意： 这些伴侣蛋白有商业来源，但我们倾向于自行纯化，以控制成本和质量。两种蛋白均保存于20 mM Tris pH 7.5、100 mM 氯化钠和0.1 mM TCEP缓冲液中，储备浓度约为160 μM。SGTA可识别具有高度疏水跨膜区（TMD）的底物，而钙调蛋白（Calmodulin）则结合中等疏水性的TMD。该伴侣蛋白混合物可识别多种不同的底物。 - 向重组后的材料中加入100 μL裂解缓冲液，使总体积达到200 μL。将此溶液加入已平衡的谷胱甘肽旋转柱中。注意，当预清除体积为200–400 μL时，谷胱甘肽旋转柱可实现最高的样品回收率。
- 将离心柱插好，在 4 °C 下以约 80 rpm 转速旋转 30 分钟，使分子伴侣与树脂结合。
- 在室温下以 700 × g 离心 2 分钟。穿流液为已去除聚集蛋白的预澄清样品。将样品置于冰上保存，并立即进行提取测定。
3. 提取实验
- 准备用于 SDS-PAGE 分析的试管。每个反应需要 4 支试管：上样 INPUT（I）、穿流 FLOW THROUGH（FT）、洗涤 WASH（W）和洗脱 ELUTE（E）。
- 向上样 INPUT 管中加入 45 μL ddH2O 样品，向穿流 FLOW THROUGH 管中加入 40 μL ddH2O，向洗涤 WASH 和洗脱 ELUTE 管中加入 0 μL。
注意：本实验中，当 WASH 和 ELUTE 样品相对于 INPUT 和 FLOW THROUGH 样品浓缩 5 倍时，可获得最佳的信噪比。由于实验过程中的稀释效应，需取 5 μL 样品用于 INPUT，10 μL 样品用于 FLOW THROUGH，以及 50 μL 样品用于 WASH 和 ELUTE。 - 向每支试管中加入 16.6 μL 的 4x SDS-PAGE 上样缓冲液。加入 SDS-PAGE 上样缓冲液前，各样品总体积为 50 μL。最终体积为 66.6 μL（50 μL 样品 + 16.6 μL 4x SDS-PAGE 上样缓冲液）。
- 向上样 INPUT 管中加入 45 μL ddH2O 样品，向穿流 FLOW THROUGH 管中加入 40 μL ddH2O，向洗涤 WASH 和洗脱 ELUTE 管中加入 0 μL。
- 组装提取实验。
- 准备提取反应体系，包含 60 μL 预清除的蛋白脂质体、5 μM GST-SGTA、5 μM GST-钙调蛋白和 2 mM ATP。除 ATP 外，将所有试剂混合，ATP 用于启动反应。用提取缓冲液补足至终体积 200 μL。
注意：由于每次提取实验使用 60 μL 样品，一次重建样品可用于三个不同的提取实验。对同一次重建样品进行阳性与阴性对照实验（+ATP 和 -ATP）。 - 将提取反应体系置于 30 °C 金属浴中预热 2 分钟。
- 准备提取反应体系，包含 60 μL 预清除的蛋白脂质体、5 μM GST-SGTA、5 μM GST-钙调蛋白和 2 mM ATP。除 ATP 外，将所有试剂混合，ATP 用于启动反应。用提取缓冲液补足至终体积 200 μL。
- 通过加入 ATP 至终浓度 2 mM 启动提取反应，并开始计时。
- 在小型离心机中短暂离心 5 秒，使 ATP 与反应体系充分混匀。在 30 °C 下孵育反应体系 30 分钟。
- 孵育期间，取 5 μL 反应液加入上样 INPUT 管中。此步骤时间可灵活掌握。
- 在此孵育期间，为每个提取反应样品平衡一根谷胱甘肽自旋柱。
- 对分子伴侣进行下拉，以分离提取的物质。
- 30 分钟孵育结束后，向反应管中加入 200 μL 提取缓冲液，使总体积达到 400 μL。将混合液加入已平衡的谷胱甘肽树脂中，在 4 °C 条件下旋转孵育 30 分钟，使结合充分。
- 在室温下以 700 × g 离心 2 分钟，收集穿流液。取 10 μL 加入 FLOW THROUGH 管中。该样品包含仍整合在脂双层中的底物。
- 用 400 μL 提取缓冲液洗涤树脂两次，弃去穿流液。第三次洗涤时保留穿流液，并取 50 μL 加入 WASH 管中。
- 通过将还原型谷胱甘肽加入提取缓冲液中，配制 5 mL 洗脱缓冲液，使其终浓度为 5 mM。每次实验均需新鲜配制。
- 向自旋柱中加入 200 μL 洗脱缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。在室温下以 700 × g 离心 2 分钟进行洗脱，保留穿流液。重复该步骤一次，使总洗脱体积达到 400 μL。
- 从洗脱液中取 50 μL 样品加入 ELUTE 管中。
| 脂质 | 摩尔百分比 | 分子量 | 平均分子量 | 25 mg 中的 µmol 数 | 25 mg 中的 mg 数 | 氯仿储备液 (mg/mL) | 25 mg 所需体积 (µL) |
| PC | 48% | 770 | 369.6 | 14.82 | 11.41 | 25 | 456.4 |
| PE | 28% | 746 | 208.88 | 8.64 | 6.45 | 25 | 258.0 |
| PI | 10% | 902 | 90.2 | 3.09 | 2.78 | 10 | 278.5 |
| DOPS | 10% | 810 | 81 | 3.09 | 2.50 | 10 | 250.1 |
| TOCL | 4% | 1502 | 60.08 | 1.23 | 1.85 | 25 | 74.2 |
| 浓度校正平均分子量 | 809.76 | ||||||
| 25 mg 中的总 µmol 数 | 30.87 | ||||||
表1： 脂质体配制的示例计算。本表的主要目标是计算经浓度校正后的脂质混合物的平均分子量，以及制备脂质体所需的每种脂质储备液的体积。分子量（MW）和储备液浓度来自产品标签。脂质种类及摩尔百分比由用户自行选择。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物珠 | Bio-Rad | 1523920 | |
| 牛肝磷脂酰肌醇 | Avanti | 840042C | PI |
| 鸡卵磷脂酰胆碱 | Avanti | 840051C | PC |
| 鸡卵磷脂酰乙醇胺 | Avanti | 840021C | PE |
| 滤膜支撑板 | Avanti | 610014 | |
| 玻璃小瓶 | VWR | 60910L-1 | |
| 谷胱甘肽自旋柱 | Thermo Fisher | PI16103 | |
| 微型挤出器 | Avanti | 610020 | |
| 合成 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸 | Avanti | 840035C | DOPS |
| 合成 1',3'-双[12-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂]-甘油 | Avanti | 710335C | TOCL |
| 1 mL 注射器 | Norm-Ject 53548-001 | ||
| 1 mL 注射器 气密型 | Avanti 610017 |
