β-半乳糖苷酶检测法评估药物诱导的寄生虫细胞毒性

摘要

来源：Alonso, V. L. 等. 体外 针对寄生虫全生命周期各阶段的药物筛选 克氏锥虫 使用表达β-半乳糖苷酶的寄生虫。 视频实验杂志 (2021)

在本视频中，我们介绍一种简单且稳健的方法，用于评估具有杀锥虫活性的药物对表达β-半乳糖苷酶的寄生虫——Trypanosoma cruzi——的细胞毒性作用。β-半乳糖苷酶可作为细胞裂解的指示剂，其活性可用于评估药物的作用效果。

方案

1. β-半乳糖苷酶检测

注意：β-半乳糖苷酶活性的定量被用作确定寄生虫数量的间接方法。预期在存在杀锥虫化合物的情况下，寄生虫生长将受到抑制，与未经处理的对照组相比，寄生虫数量减少，这将反映为β-半乳糖苷酶活性降低，因而吸光度也较低。

1. 用BZN孵育寄生虫
   1. 在96孔板中，向每孔加入100 µL相应的2倍浓度的苯并硝唑（BZN）溶液，使最终BZN浓度分别为80、40、20、10、5和2.5 µM，作用于100 µL的上鞭毛体悬液、感染后2天的Vero细胞内的无鞭毛体或前鞭毛体。
   2. 将上鞭毛体在28 °C下孵育72小时，将前鞭毛体或感染了无鞭毛体的Vero细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
      注意：每个药物浓度至少应设置三个复孔，并包括含二甲基亚砜（DMSO）的上鞭毛体、前鞭毛体和感染Vero细胞的对照培养组。
2. 比色反应
   1. 处理孵育结束后，若感染的Vero细胞或前鞭毛体使用的是含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），则需更换为100 µL的1×磷酸盐缓冲液（PBS），以避免干扰。同时设置三个仅含100 µL相应培养基（或适当使用1× PBS）的空白孔。
      注意：对于使用LIT培养基或不含酚红的DMEM培养的上鞭毛体，无需更换培养基。若仍使用含酚红的DMEM，可单独设置一个仅含DMEM的空白孔以测定基础吸光度，并在数据分析时扣除该值。 Schneider昆虫培养基为无色培养基，也可作为上鞭毛体的替代培养基。
   2. 向每孔加入40 µL氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷（CPRG）底物溶液和10 µL去垢剂溶液，使每孔终体积为250 µL，CPRG终浓度为200 µM，去垢剂终浓度为0.1%。
      注意： CPRG溶液与去垢剂可合并为50 µL总体积加入每孔。
   3. 在37 °C孵育2小时，使用酶标仪在595 nm波长处测定吸光度。
      注意： β-半乳糖苷酶酶促裂解后预期颜色变化为由黄色变为红棕色（图1A）。孵育时间可延长至4小时，氯酚红的吸收光谱在570–595 nm范围内读取均可获得相似的曲线拟合结果。在CPRG底物存在下孵育长达24小时亦显示相似的曲线拟合效果。

结果

图 1：Benznidazole 对 Dm28c 表现型无鞭毛体的 IC50 值计算。（A）96 孔板中，Dm28c 表现型无鞭毛体经不同浓度 BZN（2.5、5、10、20、40 和 80 µM）处理后，在加入 CPRG 前（1）、初始加入 CPRG 和去污剂后（2）以及与 CPRG 和去污剂孵育后显示颜色变化（3）。（B）Dm28c/pLacZ 无鞭毛体在 595 nm 处的吸光度（OD）与 BZN 对数浓度的 XY 图。采用非线性回归拟合曲线以估算 IC50 值。每个数据点表示 6 次独立生物学重复实验的平均值及标准差（误差线）。蓝色实线代表拟合曲线。缩写：CPRG =...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔板	Corning	3599
苯并咪唑	Sigma Aldrich	419656
5 mL 血清移液管（无菌）	Jet Biofil	GSP010005
10 mL 血清移液管（无菌）	Jet Biofil	GSP211010
生物安全柜	Telstar	Bio II A/P
CPRG	Roche	10 884308001	氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷
DMEM，高糖	Thermo Fisher Scientific	12100046	粉末
DMSO	Sintorgan	SIN-061	二甲基亚砜
胎牛血清	Internegocios SA	FCS FRA 500	无菌且经热灭活
Vero 细胞	ATCC	CRL-1587
微孔板分光光度计	Biotek	Synergy HTX
1.5 mL 微量离心管	Tarson	500010-N
G418 硫酸盐溶液	Roche	G418-RO	储存液浓度：50 mg/mL