一种基于孔板的检测方法：测量药物暴露下脑切片中单胺类物质的释放

摘要

来源：Pino, J. A. 等. 一种用于测量急性脑切片中内源性单胺释放的基于培养板的检测方法. J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们展示了一种检测方法，用于研究经测试药物处理后，代谢活跃的离体大鼠脑切片中神经元单胺类物质释放机制。该检测方法表明，神经兴奋类药物可诱导单胺释放 通过 细胞单胺转运体，而高浓度KCl可诱导突触囊泡胞吐介导的囊泡单胺释放。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脑切片或脑组织穿孔的离体自体单胺释放

注意：本部分所用装置由一个48孔板和一个组织固定装置组成，该固定装置由六个未装内置滤膜的微量离心滤过单元连接至碳酰气（carbogen）管线构成（图1）。制作该固定装置时，可使用坚固的塑料棒（例如细胞刮刀的杆部），用强力胶将未装内置滤膜的微量离心滤过单元粘附于其上，室温下静置干燥1-2天。内源性单胺类物质释放实验所需时间，以及苯丙胺、氟西汀和可卡因的浓度，均依据现有文献及先前实验方案确定。

1. 组织激活
   1. 将脑组织转移至外排室的每个孔中，在载片加热器上用0.5–1 mL含氧外排缓冲液于37 °C孵育30–50分钟，期间持续轻柔通气（图1B1）。
   2. 在此孵育期间，将药物稀释至实验所需的浓度。所有药物均需溶解于外排缓冲液中，浓度依据现有文献确定。
2. 第一次孵育
   1. 将带有脑组织的组织架转移至含有500 μL含氧外排缓冲液的孔中，在37 °C孵育20分钟。转移时通过轻敲组织架边缘以去除残留缓冲液，确保带入的缓冲液最少或无。
   2. 在使用药理学试剂（如单胺转运体抑制剂）的实验中，将组织样本与溶解于含氧外排缓冲液中的药物共同孵育（例如，10 μM 氟西汀，40 μM 可卡因；见 图1B2）。每孔最终体积为500 μL。
3. 第二次孵育
   1. 将带有组织的组织架转移至一组新的孔中，每孔含500 μL总外排缓冲液，可选择性加入所需浓度的药物。确保无过量缓冲液残留。每个孔代表一个实验条件的n = 1，每种实验条件需设三个重复。
   2. 一个孔中仅含含氧外排缓冲液，另一个孔含10–30 μM AMPH，最后一个孔含10–30 μM AMPH及单胺转运体抑制剂。每种药物均溶解于含氧外排缓冲液中。
   3. 在37 °C下用500 μL药物处理液孵育组织20分钟。
      注意： 可增设其他孔，例如含或不含单胺转运体抑制剂的高K+含氧外排缓冲液。每种药物均溶解于500 μL含氧外排缓冲液中。
   4. 在第二次20分钟孵育期间，收集第一步 1.2.1 中各孔的孵育液，转移至含有50 μL 1 N高氯酸或磷酸（根据HPLC类型选择，终浓度为0.1 N）的微量离心管中。样品终体积为550 μL。将微量离心管置于冰上，并标记为#1。
   5. 第二次20分钟孵育结束后，将带有脑切片或穿孔组织的组织架转移至空孔中，并将板置于冰上。将上清液转移至含有50 μL 1 N高氯酸或磷酸的微量离心管中。样品终体积为550 μL。保持微量离心管在冰上，并标记为#2。
   6. 向每个含有组织的孔中加入1 mL冰冻解剖缓冲液。用小镊子收集全部组织，并转移至洁净的微量离心管中。
   7. 将含有脑组织的离心管保存于-80 °C。弃去1 mL解剖缓冲液（图1B4）。
   8. 使用微量离心滤膜管（0.22 μm）在2,500 x g 条件下离心2分钟，过滤各次孵育所得溶液。取滤液用于通过高效液相色谱-电化学检测法测定单胺含量（图1B5）。

结果

图1：外排实验的实验装置。（A） 外排室由一个48孔组织培养板和一个连接至碳氧混合气体管路的组织固定架托盘组成。 (B) 显示内源性单胺外排实验设计的示意图，其中组织被激活 (B1)预孵育（使用/不使用单胺转运体抑制剂） (B2)，外排实验 (B3)，以及最终的样品处理流程均予以展示 （B4-B5）（C）左图显示实验人员将灌注液装入高效液...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48孔板	NA	NA	检测
无水氯化钙	Sigma Aldrich	C1016	改良人工脑脊液或外排缓冲液
D-(+)-葡萄糖	Sigma	1002608421	解剖缓冲液
L-抗坏血酸	Sigma Aldrich	A5960	解剖缓冲液
硫酸镁	Sigma	7487-88-9	KH缓冲液
超滤离心过滤单元 UltraFree	Millipore	C7554	检测 - 6个，适配48孔板
盐酸苯丙胺	Sigma Aldrich	P8013	改良人工脑脊液或外排缓冲液
氯化钾	Sigma	12636	KH缓冲液
磷酸二氢钾	Sigma	1001655559	KH缓冲液
碳酸氢钠	Sigma	S5761	解剖缓冲液
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S5761	解剖缓冲液
氯化钠	Sigma	S3014	KH缓冲液