用于测量主动脉瓣间质细胞钙浓度的钙化检测实验

摘要

来源：Bouchareb, R. 等人 分离小鼠主动脉瓣间质细胞以研究主动脉瓣钙化 体外. 视频实验杂志 (2021).

本视频展示了一种用于评估主动脉瓣间质细胞钙化的方法技术 体外该检测利用砷偶氮III试剂定量钙离子浓度，这是一种钙敏感性染料，可与钙离子反应生成紫色的钙-砷偶氮复合物。

方案

本文所描述的所有动物实验程序均已获得西奈山伊坎医学院机构核心使用委员会的批准。

1. 成年小鼠瓣膜细胞分离前的准备

1. 使用 70% v/v 乙醇清洁并灭菌 图 1A 中所示的所有手术器械，随后在高压灭菌器中灭菌 30 分钟。用 70% 乙醇清洁手术工作区。
2. 将 500 µL 青霉素-链霉素加入 50 mL 的 10 mm HEPES 中。准备一份 50 mL 的 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。将溶液置于冰上保存。
3. 配制 1 mg/mL 和 4.5 mg/mL 的胶原酶溶液，并在 15 mL 离心管中各取 5 mL 用于整个操作。为配制 5 mL 的 1 mg/mL 胶原酶溶液，将 5 mg 胶原酶与 2.5 mL 杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM，无胎牛血清 FBS）以及 2.5 mL 含抗生素（来自 步骤 1.2 的 1% 青霉素-链霉素）的 10 mM HEPES 混合。通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液，以去除任何污染。
   ​注意： 将溶液置于冰上以保护酶活性。
4. 在进行以下所有步骤前，将 DMEM 溶液预热至 37 °C。通过向 DMEM 中添加 1% 青霉素-链霉素、1% 丙酮酸钠、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 mL 支原体清除试剂（见材料表）以及 10% FBS，配制完全培养基。

2. 瓣膜细胞的分离

1. 为获得实验所需的 10⁵ 个细胞，使用五只 8 周龄的小鼠（最少三只）。将小鼠放入诱导室中，并加入浸有 1 mL 异氟烷的滤纸片，但避免小鼠直接接触滤纸。通过脚趾夹捏反射确认动物已完全麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠。在进行颈椎脱位前使用异氟烷以减轻疼痛，因为下述操作为终末性实验步骤。
2. 将小鼠置于解剖平台，用套管固定四肢以保持位置稳定。用乙醇清洁胸部和腹部区域，用剪刀切开腹部和胸部。使用小型手术剪在左心房与左心室之间剪开以放血。用 10 mL 冷的 1× PBS 灌注心脏，以清除心脏中的血液。
3. 剪下心脏，并保留升主动脉起始处约 3 mm 的部分，如 图 1B 所示。在体视显微镜下分离主动脉瓣。在心室中部水平横向剪开心脏（图 1C）。从左心室向主动脉方向剪开，并仔细分离主动脉瓣（图 1D–F）。将所有瓣膜组织收集至一个小型 35 mm 组织培养皿中。
4. 在 75 mm 细胞培养皿中用 5 mL 冷 HEPES（10 mM）（含抗生素，1% 青霉素-链霉素）清洗分离的瓣膜，以去除残留血液（图 2）。按照上述 步骤 1.3 的方法准备两管胶原酶溶液，浓度分别为 1 mg/mL 和 4.5 mg/mL。
   注意：解剖完成后，应在无菌生物安全柜中操作分离的瓣膜，以尽量减少污染。
5. 将瓣膜在 I 型胶原酶（1 mg/mL）中于 37 °C 持续振荡孵育 30 分钟（图 2）。在 150 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用 2 mL HEPES（10 mM）洗涤沉淀一次，并高速涡旋 30 秒。将管内内容物倒入 35 mm 培养皿中，用细镊子小心将组织碎片转移至新管中。
   注意： 此阶段心瓣膜间质细胞（VICs）尚未从组织中完全解离，沉淀物中仍含有组织碎片。为避免内皮细胞污染，在 步骤 2.5 涡旋后不要再次离心。
6. 将沉淀物加入含 5 mL I 型胶原酶（4.5 mg/mL）的 15 mL 管中，于 37 °C 持续振荡条件下孵育 35 分钟。用 1 mL 移液器反复吹打重悬细胞，然后在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，用 2 mL 完全 DMEM 培养基重悬沉淀。在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次以清洗细胞。
   注意： 沉淀中仍可能含有少量组织碎片。
8. 用 1 mL 完全培养基重悬沉淀，并将细胞接种至 6 孔细胞培养板的一个孔中，使用最少体积的培养基以促进细胞贴壁。将细胞置于 37 °C、5% 二氧化碳的培养箱中静置培养，避免扰动。
9. 3 天后，在显微镜下观察细胞生长情况，确认细胞在组织碎片周围良好增殖。当显微镜下可见约 1,000 个细胞时，用灭菌镊子小心移除组织碎片，并更换培养基。
   注意： 培养板应避免扰动；若未观察到足够数量的细胞，可将培养皿放回培养箱继续培养 2 天。
10. 当细胞融合度达到 70%（约 2.5 × 10⁵ 个细胞）时，进行胰酶消化后转移至 75 mm 组织培养皿中继续培养。

3. 体外钙化实验

1. 用70%乙醇清洁超净台，将DMEM培养基预热至37 °C。
2. 将100,000个细胞/条件接种至6孔板中，加入完全DMEM培养基，在37 °C培养24小时。
3. 通过混合2 mM NaH制备钙化培养基₂PO₄，10-7 M 胰岛素，以及 50 µg/mL 抗坏血酸的 DMEM 培养基（含 5% FBS）。配制 93 mL DMEM 时，加入 5 mL FBS、1 mL 抗生素（终浓度 1%）、1 mL 丙酮酸钠（100 mM）和 27.5 mg NaH₂PO₄5.8 µL 胰岛素和 5 mg 抗坏血酸。
   注意：使用 0.22 µm 滤器在使用前过滤溶液。
4. 24小时后，将上清液更换为成骨诱导培养基，在37 °C培养箱中继续培养7天。第3天时，更换新鲜的成骨诱导培养基，将培养板放回培养箱中继续完成7天的处理。
5. 7天后，移除培养基，用2 mL 1×PBS洗涤细胞两次。将细胞在1 mL 0.6 N盐酸（HCl）中37 °C孵育24小时。收集HCl溶液至1.5 mL离心管中，用旋转蒸发仪将其蒸发。将所有管中的残留物重新悬浮于60 µL HCl中。
   注意： 干燥步骤对于浓缩溶液以及确保每种条件下的体积一致非常重要。
6. 使用96孔板，利用现成的试剂盒中的偶氮胂III试剂测定钙离子浓度（参见 材料表 有关更多详细信息）。
7. 配制浓度为 10 mg/dL 的钙标准溶液。称取 10 mg 氢氧化钙（Ca(OH)₂），溶于适量去离子水中，定容至 1 L。₂）并溶于100 mL蒸馏水中。
8. 在透明的96孔板中，每孔分别加入2 µL空白溶液（0.6 N HCl）、标准溶液、样品（10 mg/dL）以及待测样品。每个处理设三个复孔，以验证移液的重复性。每孔加入200 µL试剂。
   注意： 浓度高于15 mg/dL的样本应用生理盐水1:1稀释后重新检测，结果乘以2。
9. 室温孵育反应15分钟。
   注意： 反应在60分钟内保持稳定。
10. 在650 nm处读取并记录酶标板的吸光度。使用以下公式计算样品中的钙含量：
    钙含量（mg/mL）=（样品吸光度／标准品吸光度）× 标准品浓度

结果

图1：瓣膜解剖示意图。 (A) 解剖所需全部外科器械的代表性图像，剪刀2用于切开小鼠皮肤，剪刀3用于打开胸腔。镊子5和6用于夹住皮肤并撑开胸腔。 (B) 在主动脉处保留3 mm的组织（黑色箭头）。 (C) 使用4号剪刀在心室中部剪开心脏。 (D) 使用3号剪刀将心脏向主动脉瓣方向打开。使用细镊子7和8小心地解剖主动脉瓣。瓣膜清晰可见，其上存在一些黑色斑点，为主动脉瓣组织在小鼠中的典型特征（蓝色箭头）。 (E) 放大倍数以更清楚地观察主动脉瓣。使用小剪刀4将瓣膜分离； (F...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mm 刃口剪刀	F.S.T	15000-00
偶氮胂-III 试剂盒	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	用于测定钙浓度的试剂盒
波恩剪刀	F.S.T	14184-09
氢氧化钙	SIGMA -Aldrich 	31219
I型胶原酶（125 单位/mg）	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
超细格拉夫镊	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 	16000044
精细镊	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M 溶液	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
青霉素-链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
丙酮酸钠 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
标准纹路镊	F.S.T	11000-12
外科剪刀 - 锐钝型	F.S.T	14008-14
胰蛋白酶 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054