用于测量主动脉瓣间质细胞钙浓度的钙化检测实验

摘要

来源：Bouchareb, R. 等人 分离小鼠主动脉瓣间质细胞以研究主动脉瓣钙化 体外. 视频实验杂志 (2021).

本视频展示了一种用于评估主动脉瓣间质细胞钙化的方法技术 体外该检测利用砷偶氮III试剂定量钙离子浓度，这是一种钙敏感性染料，可与钙离子反应生成紫色的钙-砷偶氮复合物。

方案

本文所描述的所有动物实验程序均已获得西奈山伊坎医学院机构核心使用委员会的批准。

1. 成年小鼠瓣膜细胞分离前的准备

1. 使用 70% v/v 乙醇清洁并灭菌 图 1A 中所示的所有手术器械，随后在高压灭菌器中灭菌 30 分钟。用 70% 乙醇清洁手术工作区。
2. 将 500 µL 青霉素-链霉素加入 50 mL 的 10 mm HEPES 中。准备一份 50 mL 的 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。将溶液置于冰上保存。
3. 配制 1 mg/mL 和 4.5 mg/mL 的胶原酶溶液，并在 15 mL 离心管中各取 5 mL 用于整个操作。为配制 5 mL 的 1 mg/mL 胶原酶溶液，将 5 mg 胶原酶与 2.5 mL 杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM，无胎牛血清 FBS）以及 2.5 mL 含抗生素（来自 步骤 1.2 的 1% 青霉素-链霉素）的 10 mM HEPES 混合。通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液，以去除任何污染。
   ​注意： 将溶液置于冰上以保护酶活性。
4. 在进行以下所有步骤前，将 DMEM 溶液预热至 37 °C。通过向 DMEM 中添加 1% 青霉素-链霉素、1% 丙酮酸钠、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、1 mL 支原体清....

结果

图1：瓣膜解剖示意图。 (A) 解剖所需全部外科器械的代表性图像，剪刀2用于切开小鼠皮肤，剪刀3用于打开胸腔。镊子5和6用于夹住皮肤并撑开胸腔。 (B) 在主动脉处保留3 mm的组织（黑色箭头）。 (C) 使用4号剪刀在心室中部剪开心脏。 (D) 使用3号剪刀将心脏向主动脉瓣方向打开。使用细镊子7和8小心地解剖主动脉瓣。瓣膜清晰可见，其上存在一些黑色斑点，为主动脉瓣组织在小鼠中的典型特征（蓝色箭头）。 (E) 放大倍数以更清楚地观察主动脉瓣。使用小剪刀4将瓣膜分离； (F.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mm 刃口剪刀	F.S.T	15000-00
偶氮胂-III 试剂盒	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	用于测定钙浓度的试剂盒
波恩剪刀	F.S.T	14184-09
氢氧化钙	SIGMA -Aldrich 	31219
I型胶原酶（125 单位/mg）	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
超细格拉夫镊	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 	16000044
精细镊	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M 溶液	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
青霉素-链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
丙酮酸钠 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
标准纹路镊	F.S.T	11000-12
外科剪刀 - 锐钝型	F.S.T	14008-14
胰蛋白酶 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054