检测 PM2.5 介导的鱼类胚胎 DNA 损伤的免疫荧光检测法

摘要

来源：Huang, Y., 等. 利用免疫荧光检测 PM_2.5 诱导的斑马鱼胚胎心脏 DNA 损伤。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种高灵敏度的基于免疫荧光的检测方法，通过检测8-OHdG和γH2AX的水平，来评估PM_2.5暴露引起的斑马鱼胚胎心脏中的氧化损伤，其中8-OHdG和γH2AX分别指示DNA损伤和DNA双链断裂。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. PM_2.5 采样与有机化合物提取

注意：PM_2.5 于 2015 年 8 月 1 日至 7 日在中国苏州城区采集，具体方法如前所述。

1. 将47 mm石英膜滤膜置于500 °C马弗炉中灼烧2 h，以去除有机组分。
2. 将一张滤膜放入PM_2.5采样器中，连续采样24 h。
3. 取出滤膜，在室温下干燥24 h。
4. 用分析天平对滤膜进行称重定量。
5. 使用二氯甲烷作为溶剂，通过索氏提取法从滤膜中提取有机组分。
6. 在60 °C水浴中结合氮气流通过旋转蒸发干燥EOM。将EOM溶于DMSO中，并于-20 °C保存。

2. 斑马鱼胚胎的收集与处理

1. 将斑马鱼饲养于循环水养殖系统中，温度维持在 28.5 ± 0.5 °C，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗。
2. 将健康的成年斑马鱼以 2:1 的雄雌比例放入养殖缸中。
3. 次日收集胚胎，并用系统水（即斑马鱼繁育用水）清洗。
4. 挑选发育正常（大小均匀、卵粒饱满、无卵凝固现象）的斑马鱼胚胎，随机分配至四个独立的直径为 7 cm 的玻璃培养皿中，每组约 50 个胚胎。
5. 从受精后 2 小时（2 hpf）至 72 小时（72 hpf），用 PM_2.5 （5 mg/L）处理胚胎，同时设置或不设置 0.25 μM 的 NAC 共同处理。以 DMSO 作为溶剂对照，终浓度为 0.1%（v/v）。

3. 斑马鱼胚胎的形态学观察与心脏解剖

1. 在72 hpf时，将胚胎转移至玻璃载片上，并在体视显微镜下观察。记录心脏畸形情况，例如心包水肿、心管弯曲异常以及心脏体积减小。
2. 计算畸形率（具有心脏缺陷的胚胎数占存活胚胎总数的百分比），并采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Turkey多重比较检验进行组间差异分析（p < 0.05 表示差异具有统计学意义）。
3. 使用0.6 mg/mL MS-222麻醉胚胎，以使其在玻璃载片上保持静止。
4. 记录30秒内心跳次数，并使用ImageJ软件量化心率。
5. 在体视显微镜下，使用一次性注射器针头从斑马鱼胚胎中解剖心脏。注意：避免破坏心脏形态。

4. 免疫荧光检测

1. 为检测 PM_2.5 诱导的斑马鱼胚胎心脏 DNA 损伤，使用疏水性屏障笔在洁净的载玻片上画一个圆圈。
2. 将 50 μL 的 4% 多聚甲醛加入 1.25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制固定液。
3. 将 3 个解剖获得的心脏组织放入一个疏水性屏障笔画出的圆圈内，在室温下孵育 20 分钟。
4. 在显微镜下倾去溶液，并在室温下干燥样品至少 5 分钟，使心脏组织完全贴附于载玻片上。
5. 用含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBST）洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
6. 将 50 μL 牛血清白蛋白（BSA）加入 1000 μL PBST 中，配制成 5% BSA 溶液，并将载玻片置于湿盒中孵育 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。
7. 倾去溶液，并用 PBST 洗涤样品三次，每次 5 分钟。
8. 将 2 μL 针对 8-OHdG 的小鼠单克隆抗体和 2 μL 针对 γH2AX 的兔多克隆抗体加入 296 μL PBST 中，配制成工作浓度的一抗混合溶液。
9. 在湿盒中，用 50 μL 一抗混合溶液（针对 8-OHdG 和 γH2AX）孵育心脏样品，室温孵育至少 1 小时，或 4 °C 过夜（过夜孵育可增强信号强度）。
10. 倾去溶液，并用 PBST 洗涤样品三次，每次 5 分钟。
11. 将 1 μL FITC 标记的山羊抗小鼠二抗和 1 μL Cy3 标记的山羊抗兔二抗加入 498 μL PBST 中，配制成工作浓度的二抗混合溶液，并将样品在避光条件下、室温下用二抗（1:500 稀释于 PBST）孵育 1 小时。
12. 倾去溶液，并在避光条件下用 PBS 洗涤样品三次，每次 5 分钟。
13. 向样品中加入 20 μL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚），室温孵育 30 分钟，进行细胞核染色。
14. 加盖盖玻片，并用指甲油封片，防止干燥和移动。随后在荧光显微镜下观察样品，并使用 ImageJ 软件定量心脏区域的荧光信号。以 DMSO 对照组样品的平均值计算相对变化，并按照步骤 3.2 确定数据的统计学显著性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-OHdG 抗体	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	一抗
分析天平	Sartorius,中国	BSA124S
BSA	Solarbio,北京,中国	SW3015	用于封闭
DAPI	Abcam, USA	ab104139	用于细胞核复染
DMSO	Solarbio,北京,中国	D8371
荧光显微镜	Olympus, 日本	IX73	用于荧光信号成像
羊抗兔 IgG Cy3	Carlsbad,USA	CW0159	二抗
羊抗兔 IgG FITC	Carlsbad,USA	RS0003	二抗
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）	Adamas-Beta, 上海, 中国	616-91-1
旋转摇床	QILINBEIER,中国	TS-1
多聚甲醛	Sigma,中国	P6148	配制 4% 多聚甲醛用于固定
磷酸盐缓冲液	HyClone,USA	SH30256.01	配制含 0.1% Tween 的 PBS 用于洗涤
PM2.5 采样器	天虹,武汉,中国	TH-150C	用于连续 24 小时 PM2.5 采样
循环水养殖系统	海生,上海,中国		用于斑马鱼的饲养
索氏提取器	正乔,上海,中国	BSXT-02	用于有机成分提取
体视显微镜	Nikon,加拿大	SMZ645	用于斑马鱼胚胎心脏解剖
三卡因甲磺酸盐（MS222）	Sigma,中国	E10521	用于麻醉斑马鱼胚胎
Tween 20	Sigma,中国	P1379
γH2AX 抗体	Abcam, USA	ab26350	一抗