检测 PM2.5 介导的鱼类胚胎 DNA 损伤的免疫荧光检测法

摘要

来源：Huang, Y., 等. 利用免疫荧光检测 PM_2.5 诱导的斑马鱼胚胎心脏 DNA 损伤。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种高灵敏度的基于免疫荧光的检测方法，通过检测8-OHdG和γH2AX的水平，来评估PM_2.5暴露引起的斑马鱼胚胎心脏中的氧化损伤，其中8-OHdG和γH2AX分别指示DNA损伤和DNA双链断裂。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. PM_2.5 采样与有机化合物提取

注意：PM_2.5 于 2015 年 8 月 1 日至 7 日在中国苏州城区采集，具体方法如前所述。

1. 将47 mm石英膜滤膜置于500 °C马弗炉中灼烧2 h，以去除有机组分。
2. 将一张滤膜放入PM_2.5采样器中，连续采样24 h。
3. 取出滤膜，在室温下干燥24 h。
4. 用分析天平对滤膜进行称重定量。
5. 使用二氯甲烷作为溶剂，通过索氏提取法从滤膜中提取有机组分。
6. 在60 °C水浴中结合氮气流通过旋转蒸发干燥EOM。将EOM溶于DMSO中，并于-20 °C保存。

2. 斑马鱼胚胎的收集与处理

1. 将斑马鱼饲养于循环水养殖系统中，温度维持在 28.5 ± 0.5 °C，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗。
2. 将健康的成年斑马鱼以 2:1 的雄雌比例放入养殖缸中。
3. 次日收集胚胎，并用系统水（即斑马鱼繁育用水）清洗。
4. 挑选发育正常（....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-OHdG 抗体	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	一抗
分析天平	Sartorius,中国	BSA124S
BSA	Solarbio,北京,中国	SW3015	用于封闭
DAPI	Abcam, USA	ab104139	用于细胞核复染
DMSO	Solarbio,北京,中国	D8371
荧光显微镜	Olympus, 日本	IX73	用于荧光信号成像
羊抗兔 IgG Cy3	Carlsbad,USA	CW0159	二抗
羊抗兔 IgG FITC	Carlsbad,USA	RS0003	二抗
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）	Adamas-Beta, 上海, 中国	616-91-1
旋转摇床	QILINBEIER,中国	TS-1
多聚甲醛	Sigma,中国	P6148	配制 4% 多聚甲醛用于固定
磷酸盐缓冲液	HyClone,USA	SH30256.01	配制含 0.1% Tween 的 PBS 用于洗涤
PM2.5 采样器	天虹,武汉,中国	TH-150C	用于连续 24 小时 PM2.5 采样
循环水养殖系统	海生,上海,中国		用于斑马鱼的饲养
索氏提取器	正乔,上海,中国	BSXT-02	用于有机成分提取
体视显微镜	Nikon,加拿大	SMZ645	用于斑马鱼胚胎心脏解剖
三卡因甲磺酸盐（MS222）	Sigma,中国	E10521	用于麻醉斑马鱼胚胎
Tween 20	Sigma,中国	P1379
γH2AX 抗体	Abcam, USA	ab26350	一抗