基于脑电图的记录技术记录癫痫样活动

Abstract

来源:Carvalho， M. et al.， 鼻皮层-海马器官型切片培养物中癫痫发生的模型。J. Vis. Exp. （2021 年）。

该视频描述了使用电生理学或 EEG 设置在体外记录鼻皮层-海马器官型切片癫痫样活动的技术。这有助于研究癫痫发生的动力学和进展，并筛选治疗癫痫的潜在治疗靶点。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 鼻皮层-海马切片的制备

注意:鼻皮层海马切片的制备使用 P6-7 Sprague-Dawley 大鼠。

1. 培养设置和培养基制备
   1. 在培养前一天，准备所需的培养基并将其置于 4 °C。
   2. 准备解剖培养基:Gey 平衡盐溶液 （GBSS） 中的 25 mM 葡萄糖。
   3. 准备培养基:50% Opti-MEM、25% HBSS、25% 马血清 （HS）、25 mM 葡萄糖、30 μg/mL 庆大霉素。
   4. 准备维持培养基:Neurobasal-A （NBA）、2% B27、1 mM L-谷氨酰胺、30 μg/mL 庆大霉素、HS（15%、10%、5% 和 0%）。
2. 大脑收集
   1. 在开始培养之前，用 P1000 移液器向 6 孔板的每个孔中加入 1.1 mL 培养基，并将其置于 37 °C。
   2. 将所有设备（解剖显微镜、组织切碎机、解剖灯、解剖工具、电极、板、插入物和滤纸）放入生物安全柜内，并在紫外线下消毒 15 分钟。
   3. 将切片厚度调整为 350 μm。
   4. 从冰箱中取出 GBSS。将 5 mL GBSS 添加到六个培养皿中。每只动物需要 6 个培养皿。
   5. 对老鼠幼崽实施安乐死。用锋利的剪刀在动物的脑干底部进行斩首。
   6. 在冷 GBSS 中清洗动物头部 3 次，然后将其放入安全柜内。
3. 组织分离和切片制备
   1. 将锋利的镊子牢固地插入眼窝以固定头部。
   2. 用细剪刀沿中线从椎孔开始切开皮肤/头皮，直到额叶，然后将其放在一边。
   3. 以相同的方式切割颅骨并沿着大脑横裂（大脑和小脑之间的空间）。用弯曲的长镊子将其分开。
   4. 用抹刀丢弃嗅球。从头部取出大脑，将其置于冰冷的 GBSS 中，背表面朝上（图 1A）。
   5. 将细镊子插入小脑，沿着中线移动，刮刀非常小心地打开每个半球（图 1B）。
   6. 用短曲线镊子小心地去除覆盖海马体的多余组织，不要接触海马体结构。然后用刮刀在每个海马体下方切开（图 1C）。
   7. 拿起一个半球，将其放在滤纸上，海马体朝上。对另一个半球重复该过程，并将其与第一个半球平行放置在滤纸中。将滤纸放在组织切碎机上，使半球垂直于刀片，并将半球切成 350 μm 切片（图 1D）。
   8. 将切片的组织放入装有冷 GBSS 的培养皿中（图 1E）。
   9. 使用圆头电极小心地分离切片（图 1F）。仅保留具有结构完整的鼻皮层和海马体的切片。DG 和 CA 区域以及内嗅和鼻周围皮层都应该得到完美定义（图 1G）。
   10. 将每个切片放在插入物上（图 1H-I），用刮刀和圆尖电极。用 P20 移液器去除每个切片周围多余的解剖培养基（图 1J）。四个鼻皮层海马切片可以在单个插入片段中培养（图 1K）。
4. 培养物维护
   1. 每隔一天更换一次培养基。
   2. 在 37 °C 下加热培养基。
   3. 从培养箱中取出板。用镊子握住塑料边缘，拿起每个插入物（图 1L）。
   4. 用另一只手从孔中吸出培养基。将插入物放回孔中，用 P1000 移液器加入 1 mL 新鲜加热的培养基（图 1M）。对所有插入重复此作。确保膜和介质之间没有气泡。
      注意:癫痫样切片在培养基中逐渐且受控地剥夺血清。从 9 Days In Vitro （DIV） 开始，切片将保留在 NBA 中，没有 HS。

2. 电生理记录

>注意:在界面型腔室中以 7、14 和 21 DIV 在鼻皮层-海马器官型切片中进行电生理记录。使用放大器获取记录，进行数字化，并使用软件进行分析。所有录音都经过带通滤波（60 Hz 的八极点贝塞尔滤波器和 600 Hz 的高斯滤波器）。

1. 设置准备
   1. 用 1 mL B27 和 250 μL L-谷氨酰胺制备 50 mL NBA 培养基。在 37 °C 下预热。
   2. 在闭路中设置电生理学设置。验证流速是否为 2 mL/min。
   3. 打开车箱 （5% CO₂/95% O₂） 阀并检查系统中的水位。
   4. 将滤纸放入界面记录室中以排出多余的介质，并将镜头清洁纸放入镜框下方，为切片提供介质。
   5. 打开温度控制器、放大器和显微作器。
   6. 在开始记录之前，让界面室中的温度稳定在 37 °C。
   7. 制备人工脑脊液（aCSF:124 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、10 mM 葡萄糖、2 mM CaCl₂、1 mM MgSO₄ pH 值为 7.4）并用它用注射器填充玻璃电极。将其放入接收电极中。
2. 自发活动的记录
   1. 温度稳定后，从培养箱中取出板，并用高度锋利的刀片从插入物上切下一片。将其放入装有一滴培养基的 60 mm 板中。把它带到界面记录室。
   2. 将切片放入界面室中，海马体位于右下角。将接收电极置于 CA3 金字塔形电池层中。
   3. 继续进行连续采集协议并记录 30 分钟。

Results

图 1:制备鼻皮层-海马器官型切片的详细程序。（A） 从头部取出大脑，将其放入冰冷的 GBSS 中，背表面朝上。（B） 将镊子插入小脑。通过中线打开大脑，去除海马体上多余的组织。（C） 用刮刀在海马体下方切开，如箭头所示。（D） 将海马体面朝上并彼此平行放在滤纸上，并在组织切碎机上切下 350 μm 切片。（E） 将切片的海马体放入冰冷的 GBSS 中。（F） 在圆头玻璃电极的帮助下分离切片。（G） 仅选择描绘完整鼻皮层和海马体的切片。（H， I）在圆头玻璃电极的帮助下，将每片推到刮刀上并将其放在插入物上。（J

Materials