基于脑电图的癫痫样活动记录技术

摘要

来源：Carvalho, M. 等，内嗅皮层-海马体脑片培养中癫痫发生的模型。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了使用电生理学或脑电图（EEG）装置在体外记录鼻周皮层-海马器官型脑片癫痫样放电活动的技术。该技术有助于研究癫痫发生的动态过程及进展，并可用于筛选治疗癫痫的潜在治疗靶点。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 鼻周皮层-海马切片的制备

注意：内嗅皮层-海马切片的制备使用 P6-7 天的 Sprague-Dawley 大鼠。

1. 培养设置与培养基制备
   1. 在接种培养前一天，准备好所需培养基，并将其置于 4 °C 保存。
   2. 制备解剖用培养基：在 Gey's 平衡盐溶液（GBSS）中加入 25 mM 葡萄糖。
   3. 制备培养用培养基：50% Opti-MEM、25% HBSS、25% 马血清（HS）、25 mM 葡萄糖、30 µg/mL 庆大霉素。
   4. 制备维持培养基：Neurobasal-A（NBA）、2% B27、1 mM L-谷氨酰胺、30 µg/mL 庆大霉素，以及不同浓度的马血清（15%、10%、5% 和 0%）。
2. 脑组织获取
   1. 在开始培养前，用 P1000 移液器向 6 孔板的每个孔中加入 1.1 mL 培养基，并将其置于 37 °C 环境中。
   2. 将所有设备（解剖显微镜、组织切片机、解剖灯、解剖工具、电极、培养板、插入物和滤纸）放入生物安全柜内，并在紫外线下灭菌 15 分钟。
   3. 将切片厚度调整为 350 µm。
   4. 从冰箱中取出 GBSS。向六个培养皿中各加入 5 mL GBSS。每只动物需要六个培养皿。
   5. 处死幼鼠。使用锋利的剪刀在动物脑干基底部进行断头操作。
   6. 用冷 GBSS 将动物头部清洗三次，并将其移入安全柜内。
3. 组织分离与切片制备
   1. 用尖头镊子牢固插入眼眶以固定头部。
   2. 使用细剪刀从枕骨大孔开始沿中线剪开头皮/皮肤，直至额叶，并将剪下的组织移至一旁。
   3. 以相同方式剪开颅骨，并沿大脑横裂（大脑与小脑之间的间隙）剪开。使用弯曲长镊将其分开。
   4. 用刮匙弃去嗅球。将脑组织从头骨中取出，背侧朝上置于冰冻的 GBSS 中（图 1A）。
   5. 将细镊插入小脑，并沿中线使用刮匙小心地分开两侧半球（图 1B）。
   6. 使用短弯镊小心去除覆盖在海马上的多余组织，避免接触海马结构。然后用刮匙在每个海马下方进行切割（图 1C）。
   7. 取一个脑半球，将其海马面朝上放置在滤纸上。重复操作处理另一侧半球，并将其平行放置在滤纸上的第一个半球旁。将滤纸置于组织切片机上，使半球与刀片垂直，切成 350 μm 厚的切片（图 1D）。
   8. 将切好的组织放入盛有冷 GBSS 的培养皿中（图 1E）。
   9. 使用圆头电极小心分离切片（图 1F）。仅保留结构完整的鼻周皮层和海马切片。齿状回（DG）和 CA 区域应清晰可辨，内嗅皮层和外嗅皮层也应界限分明（图 1G）。
   10. 用刮匙和圆头电极将每个切片转移至插入物上（图 1H-I）。使用 P20 移液器吸除每个切片周围的多余解剖培养基（图 1J）。每个插入物可培养四个鼻周皮层-海马切片（图 1K）。
4. 培养维持
   1. 每隔一天更换一次培养基。
   2. 将培养基预热至 37 °C。
   3. 从培养箱中取出培养板。用镊子夹住插入物的塑料边缘将其取出（图 1L）。
   4. 用另一只手吸除孔中的培养基。将插入物放回孔中，用 P1000 移液器加入 1 mL 新鲜预热的培养基（图 1M）。对所有插入物重复此操作。确保膜与培养基之间无气泡残留。
      注意： 类癫痫样切片在培养基中经历逐步且受控的血清剥夺。自体外培养第 9 天（DIV）起，切片在不含马血清（HS）的 NBA 培养基中维持培养。

2. 电生理记录

注意：在7、14和21天体外培养（DIV）时，于界面式记录舱中对嗅周皮层-海马体的器官型脑片进行电生理记录。记录通过放大器获取，经数字化后由软件进行分析。所有记录均经过带通滤波处理（八极贝塞尔滤波器截止频率为60 Hz，高斯滤波器截止频率为600 Hz）。

1. 实验准备
   1. 准备50 mL NBA培养基，加入1 mL B27和250 μL L-谷氨酰胺，在37 °C下预热。
   2. 将电生理装置设置为闭路系统，确认流速为2 mL/min。
   3. 打开碳氧混合气（5% CO₂/95% O₂）阀门，并检查系统中的水位。
   4. 将滤纸放入界面记录室以排出多余培养基，将镜头清洁纸置于框架下方，为脑片提供培养基。
   5. 打开温度控制器、放大器和显微操作器。
   6. 在开始记录前，使界面记录室的温度稳定在37 °C。
   7. 制备人工脑脊液（aCSF：124 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、10 mM葡萄糖、2 mM CaCl₂、1 mM MgSO₄，pH 7.4），用注射器将aCSF注入玻璃电极，并将电极放入接收电极中。
2. 自发活动记录
   1. 待温度稳定后，从培养箱中取出培养板，用非常锋利的刀片从插件上切下一枚脑片，将其置于盛有一滴培养基的60 mm培养皿中，然后转移至界面记录室。
   2. 将脑片放置于界面记录室中，使海马位于右下角，将接收电极置于CA3区锥体细胞层。
   3. 启动连续采集程序，记录30分钟。

结果

图 1：鼻皮质-海马体脑片制备的详细步骤。（A）从头部取出脑组织，将其置于冰冻的GBSS中，背侧朝上。（B）将镊子插入小脑部位，沿中线切开脑组织，并去除海马体上方的多余组织。（C）用刮匙在海马体下方进行切割，如箭头所示。（D）将两个海马体朝上并平行放置于滤纸上，在组织切片机上切成350 µm厚的切片。（E）将切好的海马体组织置于冰冻的GBSS中。（F）借助圆头玻璃电极分离各切片。（G）仅选取显示完整鼻皮质与海马体结构的切...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液 (aCSF)			自制
B-27™ 补充剂 (50X)，无血清	Thermo Fisher Scientific	17504-044
手术刀片（用于刀柄）	Fine Science Tools	10011-00
牛血清白蛋白 (BSA)	NZYTech	MB04602	使用 5% BSA 稀释一抗。将 0.5 g BSA 加入 10 mL PBS 中。
脑组织切片孵育系统	Warner Instruments
细胞培养插件，30 mm，亲水性聚四氟乙烯 (PTFE) 	Millipore SAS	PICM03050
常规培养箱 	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Function Line	设定为 37 °C 和 5% CO2
盖氏平衡盐溶液 (GBSS)’ 	Biological Industries	01-919-1A
玻璃电极 	Science Products	GB150F-10	圆头，自制
界面式孵育室 	Warner Instruments	BSC-HT Haas Top
弯头虹膜刮匙	Fine Science Tools	 10092-12
镜头清洁纸	TIFFEN
L-谷氨酰胺溶液 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientific	25030-024
组织切片机	The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	设定为 350 μm