用于评估离体癫痫模型中细胞死亡的神经元死亡检测法

摘要

来源：Carvalho, M.，等，内嗅皮层-海马体器官型脑片培养中癫痫发生的模型。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了评估鼻周皮层-海马体器官型脑片中神经元死亡的技术。神经元死亡发生 通过 进展性癫痫发作——类似 体内 癫痫——通过使用碘化丙啶和免疫荧光对死亡细胞进行双重染色来检测。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 制备鼻周皮层-海马切片

注意：内嗅皮层-海马切片的制备使用 P6-7 天的 Sprague-Dawley 大鼠。

1. 培养设置与培养基制备
   1. 在接种培养前一天，准备好所需的培养基，并将其置于 4 °C 保存。
   2. 制备解剖用培养基：在格氏平衡盐溶液（GBSS）中加入 25 mM 葡萄糖。
   3. 制备培养用培养基：50% Opti-MEM、25% HBSS、25% 马血清（HS）、25 mM 葡萄糖、30 µg/mL 庆大霉素。
   4. 制备维持培养基：Neurobasal-A（NBA）、2% B27、1 mM L-谷氨酰胺、30 µg/mL 庆大霉素，以及不同浓度的马血清（HS，分别为 15%、10%、5% 和 0%）。
2. 脑组织获取
   1. 在开始培养前，使用 P1000 移液器向 6 孔板的每个孔中加入 1.1 mL 培养基，并将其置于 37 °C 环境中预热。
   2. 将所有器械（解剖显微镜、组织切片机、解剖灯、解剖工具、电极、培养板、插入式培养插件和滤纸）放入生物安全柜内，并在紫外线下灭菌 15 分钟。
   3. 将切片厚度调整为 350 µm。
   4. 从冰箱中取出 GBSS 溶液，向六个培养皿中各加入 5 mL 冷 GBSS。每只动物需要六个培养皿。
   5. 处死新生大鼠，使用锋利剪刀在脑干基部进行断头操作。
   6. 用冷 GBSS 将动物头部清洗三次，并将其移入安全柜内。
3. 组织分离与切片制备
   1. 用尖头镊子牢固插入眼眶以固定头部。
   2. 使用细剪刀从枕骨大孔开始沿中线剪开头皮/皮肤，直至额叶，并将剪开的组织移至一旁。
   3. 以相同方式剪开颅骨，并沿大脑横裂（大脑与小脑之间的间隙）进行切割，使用弯头长镊子将组织分开。
   4. 用刮铲弃去嗅球，将脑组织从头颅中取出，置于冰冻的 GBSS 中，背侧朝上 (图 1A)。
   5. 将细镊插入小脑，并沿中线使用刮铲小心地分开两侧半球 (图 1B)。
   6. 使用短弯头镊子小心去除覆盖在海马体上的多余组织，避免触碰海马结构。随后用刮铲在每个海马体下方进行切割 (图 1C)。
   7. 取一个半球，将其海马体朝上放置在滤纸上。重复操作处理另一侧半球，并将其平行放置于同一张滤纸上。将滤纸置于组织切片机上，使半球方向与刀片垂直，切成 350 μm 厚的切片 (图 1D)。
   8. 将切好的组织放入盛有冷 GBSS 的培养皿中 (图 1E)。
   9. 使用圆头电极小心分离切片 (图 1F)。仅保留内嗅皮层和海马体结构完整的切片。齿状回（DG）和 CA 区域应清晰可辨，内嗅皮层和外嗅皮层也应界限分明 (图 1G)。
   10. 使用刮铲和圆头电极将每个切片转移至插入式培养插件上 (图 1H-I)。用 P20 移液器吸除每个切片周围的多余解剖液 (图 1J)。每个插入式插件可培养四个内嗅皮层-海马体切片 (图 1K)。
4. 培养维持
   1. 每隔一天更换一次培养基。
   2. 将培养基预热至 37 °C。
   3. 从培养箱中取出培养板，用镊子夹住插入式插件的塑料边缘将其取出 (图 1L)。
   4. 用另一只手吸除孔中的旧培养基，将插件放回原孔中，使用 P1000 移液器加入 1 mL 新鲜预热的培养基 (图 1M)。对所有插件重复此操作。确保膜与培养基之间无气泡残留。
      注意： 模拟癫痫样活动的切片在培养基中经历逐步且受控的血清剥夺过程。自体外培养第 9 天（DIV）起，切片在不含马血清（HS）的 NBA 培养基中维持培养。

2. PI 摄取实验

注意：通过检测细胞对荧光染料碘化丙啶（PI）的摄取来评估细胞死亡。PI 是一种极性化合物，能够进入细胞膜受损的细胞，并与 DNA 结合后发出红色荧光（吸收波长 493 nm，发射波长 630 nm）。由于 PI 不能穿透活细胞的细胞膜，因此可用于检测细胞群体中的死亡细胞。

1. PI 孵育
   1. 用培养基新鲜配制 PI 储存液的 1:10 稀释液。
   2. 进行 PI 摄取实验时，将培养板从培养箱中取出，小心提起插入式培养插件。使用 P20 移液器向培养基中加入 13 µL PI，使终浓度达到 2 µM。在将插入件放回原位前，轻轻晃动培养板。确保组织切片下方无气泡。
   3. 将组织切片放回 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。
   4. 按照下一节所述步骤进行免疫组织化学实验。由于 PI 对光敏感，需用铝箔覆盖培养板。

3. 免疫组织化学

注意：在免疫组织化学中，使用了神经元特异性抗体以及能够区分小胶质细胞和星形胶质细胞静息与活化表型的抗体，以评估鼻周皮层-海马癫痫样器官型脑片中神经元死亡程度和胶质增生情况。

1. 组织固定
   1. 从培养箱中取出培养板，吸除培养基。使用 P1000 移液器在切片上下方各加入 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA），于室温下固定 1 小时。
   2. 去除 PFA，加入 1 mL PBS。同样在切片上下方均加入 PBS。
   3. 将切片置于 PBS 中，于 4 °C 保存备用。始终用封口膜包裹培养板以防止干燥。
2. 免疫染色步骤
   1. 用 1 mL PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
   2. 在 PBS 中配制含 1% Triton-X100、10% HS 和 10% BSA 的通透/封闭液。另配制 5% BSA 溶液。
   3. 用疏水笔画出两个矩形区域 (图 2A)。使用非常锋利的刀片从插入物上切下组织切片 (图 2B)。每张载玻片放置两个切片 (图 2C)，并用 P200 移液器在每个切片上加 140 µL 通透/封闭液。于室温孵育 3 小时。
   4. 将一抗用含 5% BSA 的 PBS 稀释至工作浓度。于 4 °C 孵育过夜。
   5. 加入二抗，于室温孵育 4 小时。从本步骤开始需避光操作，因涉及荧光染料。
   6. 在每个切片上滴加 50 μL Hoechst 溶液，于室温孵育 20 分钟。
   7. 每次孵育之间进行洗涤。始终用 PBS-T 洗涤三次，每次 10 分钟。
   8. 去除 Hoechst 溶液，并按建议进行洗涤。
   9. 在每个切片上加 50 μL 封片介质，盖上盖玻片，并用指甲油封边 (图 2D)。
   10. 于室温下干燥 24 小时。
   11. 在共聚焦显微镜下观察免疫染色结果。染色后的切片保存于 -20 °C。

结果

图 1：鼻周皮层-海马体器官型脑片制备的详细步骤。（A）从头部取出脑组织，将其置于冰上预冷的GBSS中，背侧朝上。（B）将镊子插入小脑部位，沿中线打开脑组织，并去除覆盖在海马体上方的多余组织。（C）用解剖刀在海马体下方进行切割，如箭头所示。（D）将两个海马体并列、腹面朝上放置于滤纸上，使用组织切片机切割成350 µm厚的切片。（E）将切好的海马体组织置于冰上预冷的GBSS中。（F）借助圆头玻璃电极分离各切片。（G）仅选取显示完整鼻周皮层和海马体结构的切片。（H, I

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 离心管，锥形底	康宁	430829
70% 乙醇	Manuel Vieira, Lda	UN1170
抗 NeuN（兔）	Werfen	16712943S	按1:500的比例稀释
B-27™ 无血清补充剂（50倍浓缩）	赛默飞世尔科技	17504-044
手术刀柄用刀片	Fine Science Tools	10011-00
牛血清白蛋白（BSA）	NZYTech	MB04602	使用5% BSA稀释一抗。将0.5 g BSA加入10 mL PBS中。
脑/组织切片孵育系统	Warner Instruments
细胞培养小室，30 mm，亲水性聚四氟乙烯	Millipore SAS	PICM03050
冷光源	SCHOTT	KL 300 LED
共聚焦激光显微镜	Zeiss	LSM 710
常规培养箱	赛默飞世尔科技 Heraeus	BB15，功能线	设定为37 °C 和 5% CO₂
D(+)-葡萄糖一水合物	默克密理博	1.08342.1000
D-(+)-葡萄糖溶液，45% 水溶液	Sigma	G8769
二水合磷酸氢二钠	默克密理博	1.06580.1000
解剖显微镜/放大镜	MEIJI TECHNO CO. LTD	122285
与Alexa Fluor 488偶联的驴抗兔IgG（H+L）	Invitrogen	A21206	按1:500的比例稀释
杜蒙特 #5 精细镊子 Biologie Inox	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5 镊子 标准型 Inox	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #7 镊子 标准 Dumoxel	Fine Science Tools	11271-30
Dumont 医用 #7S 钢制短弯镊	Fine Science Tools	11273-22
庆大霉素储备液，50 mg/mL	赛默飞世尔科技	15750-037
盖’格氏平衡盐溶液（GBSS）	生物工业公司	01-919-1A
玻璃电极	科学产品	GB150F-10	圆头自制工具
玻璃巴斯德吸管，230 mm	VWR International	612-1702
汉克’Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)	赛默飞世尔科技	24020-091
马血清，热灭活（HS）	赛默飞世尔科技	26050-088
盐酸	默克密理博	1.09057.1000
疏水笔	Dako	S200230-2
INCU-Line IL10	VWR	390-0384
虹膜匙，弯型	Fine Science Tools	10092-12
Labculture II级生物安全柜	HERASafe	HS 12
镜头清洁纸	TIFFEN
L-谷氨酰胺溶液 200 mM（Q）	赛默飞世尔科技	25030-024
0.5 mL 微量离心管，聚丙烯材质	SARSTEDT	72,699
1.5 mL 微量离心管，聚丙烯材质	SARSTEDT	72.690.001
2.0 mL 微量离心管，聚丙烯材质	SARSTEDT	72.691
显微镜盖玻片，24 mm × 60 mm	Marienfeld	102242
指甲油	点击é
Neurobasal-A 培养基 (NBA)	赛默飞世尔科技	10888-022
Opti-MEM® 低血清培养基	赛默飞世尔科技	31985-047
多聚甲醛，粉末	VWR Chemicals	2,87,94,295
蠕动泵	Gilson	M312
磷酸盐缓冲液（PBS）			自制。在免疫组织化学检测中，使用含0.5% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS-T）洗涤切片。
水中磷酸盐标准溶液，PO43-	BDH ARISTAR	452232C
移液器套装	Gilson	P2、P10、P20、P100、P200、P1000
铂金 5 号刀片	吉列
碘化丙啶（PI）	Sigma-Aldrich	P4170-25MG
定性滤纸，纤维素，1号，55 mm	Whatman	1001-055	中等保留 11µm
定性滤纸，纤维素，1号，90 mm	Whatman	1001-090	中等保留 11µm
手术刀柄	Fine Science Tools	91003-12
无针头滑动针帽胰岛素注射器 1 mL	SOL-M	161000
直头尖头学生剪 12厘米	精细科学工具	91402-12
SuperFrost Plus™ 黏附载玻片	赛默飞世尔科技	J1800AMNZ
经TC处理的无菌60 x 15 mm组织培养皿	康宁	CORN430166
经TC处理的无菌6孔板	康宁	CORN3516
组织切片机	Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	设为350 μm
Triton X-100	BDH	14630
Tween-20	Sigma	P2287