利用线虫多聚谷氨酰胺聚集检测法鉴定化合物的神经保护作用

摘要

来源：Wang, Q. 等. 秀丽隐杆线虫作为发现抗多聚谷氨酰胺介导神经毒性的生物活性化合物的模型系统. J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了一种 体内 一种用于筛选神经保护性测试化合物在减少线虫体壁肌细胞中多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集及改善聚集相关蛋白毒性方面保护潜力的方法。

方案

1. 多聚谷氨酰胺（PolyQ）聚集实验

1. 聚Q蛋白聚集实验用线虫的制备
   1. 将300–500条同步化的AM141 L1幼虫转移至含500 µL S培养基（含OP50，OD₅₇₀ 0.7–0.8）和5 mg/mL的黄芪多糖，通常每个处理组每个时间点设一孔。
   2. 用封口膜密封培养板，在20 °C、120 rpm条件下分别振荡培养24、48、72和96小时。
   3. 在无菌的1.5 mL微量离心管中收集线虫，并用M9缓冲液洗涤 >3 次离心（1000 × g 静置1分钟，以去除残留的OP50。将AM141线虫重悬于M9缓冲液中，并准备好进行成像。
2. 荧光图像采集与数据分析
   注意数据可通过该高内涵成像系统自动分析。若无自动化成像设备，可采用常规方法制备琼脂糖垫，结合普通荧光显微镜进行图像采集，亦可达到类似效果。
   1. 将10-15条线虫转移至384孔板的每个孔中（每孔终体积为80 µL）。每种处理设置10个重复孔。
   2. 每孔加入 10 µL 200 mM 叠氮化钠以麻痹线虫，并静置 5–10 分钟，使线虫沉降至孔底。
   3. 将培养板放入高内涵成像系统中以获取荧光图像（参见 材料表 有关设备和软件信息）。
   4. 打开图像采集软件并设置以下参数。
      1. 打开 平板获取设置 窗口并创建新的实验集并命名。
      2. 选择 放大倍数 作为 2x, 相机像素合并 作为 1，和 培养皿类型 作为 384孔板.
      3. 设置待访问的孔和位点（单个位点）。
      4. 选择荧光素异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate,FITC滤光片 并启用基于图像的对焦选项。
      5. 设置 暴露 作为 300 ms.
         注意： 上述设置可进行测试和调整，以优化成像参数。
      6. 保存 图像采集 设置并点击 获取培养板 运行按钮。
   5. 使用图像分析软件分析图像数据。
      1. 打开 审查平板数据 窗口并选择 测试板 用于图像分析。
      2. 双击一个测试孔以显示其图像。
      3. 选择 计数细胞核 作为分析方法并单击 配置设置 按钮以弹出一个窗口进行以下设置。
      4. 定义来自 FITC 通道的源图像并选择 标准算法.
      5. 设置图像分析参数如下：近似最小宽度 = 10 µm（= 2 像素）；近似最大宽度 = 50 µm（= 12 像素）；局部背景以上强度 = 1,000–2,000 灰度级。
      6. 测试当前设置以优化分析方法。
      7. 保存设置并对所有孔进行分析。
         注意： 完成一块384孔板的分析大约需要20分钟。
      8. 导出 总细胞核 每个孔中Q40::YFP聚集体的总数。
   6. 统计每个孔中的线虫数量。
   7. 计算每组线虫中Q40::YFP聚集体的平均数量，并对每个时间点的数据进行非线性曲线拟合。
   8. 计算抑制指数：
      抑制指数 = (N_对照 - N_样本) / N对照
      其中 N_对照 和 N_样本 分别为对照组和处理组中Q40::YFP聚集体的平均数量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
秀丽隐杆线虫 品系
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
大肠杆菌 品系
OP50	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
试剂
叠氮化钠	国药集团化学试剂有限公司	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
仪器设备
384孔细胞培养板	Nest Biotechnology Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=zh&&product_id=85
48孔细胞培养板	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=zh&&product_id=85
荧光显微镜	广州微拍光学科技有限公司	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
高内涵成像系统	Molecular Devices	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/产品/细胞成像系统#高内涵成像
微量离心机	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Home/Goods/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/CN/zh/product/sigma/p7793?context=product
显微镜数码相机	广州微摄光学科技有限公司	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
软件
图像采集与分析软件	Molecular Devices	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/产品/细胞成像系统/采集与分析软件/metaxpress