一种用于研究受试化合物对线虫中多聚谷氨酰胺介导的神经毒性的效应的检测方法

摘要

来源：Wang, Q. 等，利用 Caenorhabditis elegans 作为模型系统发现抗多聚谷氨酰胺介导神经毒性的生物活性化合物。视频实验杂志 (2021)

在本视频中，我们介绍了一种评估受试化合物黄芪多糖对Caenorhabditis elegans中由多聚谷氨酰胺（polyQ）介导的神经毒性所致神经元存活影响的神经保护作用的方法。该检测方法利用在ASH神经元中表达与GFP融合的异常扩增多聚Q重复序列的Caenorhabditis elegans，以测定经受试化合物处理后的神经元存活情况。

方案

1. 多聚谷氨酰胺介导的神经毒性检测

1. 测试样品对 C. elegans 的处理
   1. 为准备用于多聚谷氨酰胺（polyQ）神经毒性检测的线虫，将300–500条同步化的HA759 L1期幼虫转移至48孔板的每个孔中，每孔加入500 µL含有OP50（OD₅₇₀为0.7–0.8）和5 mg/mL黄芪多糖的S培养基；通常每种处理设置三个重复孔。
   2. 用封口膜密封培养板，在15 °C、120 rpm条件下振荡培养3天。
   3. 通过离心收集线虫，并用M9缓冲液洗涤3–5次。将线虫重悬于M9缓冲液中，用于后续神经元存活率和回避行为检测。
2. 琼脂糖垫的制备
   1. 将2 g琼脂糖加入100 mL M9缓冲液（2%，w/v），在微波炉中加热至接近沸腾。
   2. 将0.5 mL熔化的琼脂糖滴加到置于两块2 mm厚玻璃板之间的1 mm厚显微镜载玻片中央。垂直覆盖另一块载玻片。待琼脂糖冷却凝固后，轻轻移去上层载玻片。
3. ASH神经元存活率检测
   1. 在琼脂糖垫上滴加一滴20 mM叠氮化钠。将15–20条HA759线虫转移至液滴中以固定其活动。
   2. 轻轻盖上盖玻片，将载玻片置于配备数码相机的荧光显微镜下。选择40倍物镜和FITC滤光片，检测线虫头部区域表达GFP阳性的ASH神经元。
   3. 每组随机选取超过50条线虫，统计其头部区域具有GFP标记的双侧ASH神经元的线虫数量。计算ASH神经元的存活率：
      神经元存活率（%）=
      其中N_survival和N_total分别为每组中GFP阳性ASH神经元线虫的数量和该组检测的线虫总数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<strong><em>秀丽隐杆线虫</em> 品系</strong>
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	秀丽隐杆线虫&nbsp;遗传学中心（CGC）		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
<strong><em>E. coli</em> 品系</strong>
OP50	秀丽隐杆线虫&nbsp;遗传学中心（CGC）		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
<strong>试剂</strong>
琼脂糖	Biowest	111860
叠氮化钠	国药集团化学试剂有限公司	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af<br/> 551e96ff5f07cd
<strong>设备</strong>
48孔细胞培养板	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=zh&amp;product_id=85
荧光显微镜	广州微摄光学科技有限公司	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
高内涵成像系统	Molecular Devices	ImageXpress Pico	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
微型离心机	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
显微镜数码相机	广州微视光学科技有限公司	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
微波炉	Midea Corp.	&nbsp;M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/CN/zh/product/sigma/p7793?context=product
<strong>软件</strong>
图像采集与分析软件	Molecular Devices	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/产品/细胞成像系统/采集与分析软件/metaxpress