使用渗透回避测定法检查转基因蠕虫的化学回避行为

Abstract

来源:Wang， Q. et al.， Z. 秀丽隐杆线虫作为发现针对聚谷氨酰胺介导的神经毒性的生物活性化合物的模型系统。J. Vis. Exp. （2021 年）。

该视频描述了一种渗透回避测定法，用于检查转基因蠕虫模型中的化学回避行为。在存在高渗透屏障和化学引诱剂的板中测试回避行为。神经元功能丧失的蠕虫被化学引诱剂吸引，穿过高渗屏障，并因麻醉溶液而在诱捕区瘫痪。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

注意:有关本协议中使用的溶液配方，请参见表 1。

1. 秀丽隐杆线虫测定材料的制备

1. 秀丽隐杆线虫菌株的维持
   1. 获得秀丽隐杆线虫（AM141 和 HA759）和大肠杆菌（OP50 和 NA22）菌株（参见材料表）。
   2. 将线虫维持在用大肠杆菌 OP50 接种的线虫生长培养基 （NGM） 板上，AM141 为 20 °C 或 HA759 为 15 °C。
2. 大肠杆菌 OP50 细菌培养物的制备
   1. 从 Luria-Bertani （LB） 条纹板中挑选一个大肠杆菌 OP50 菌落，并将其接种到 50 mL 液体 LB 培养物中。
   2. 将 OP50 细菌在摇床中于 37 °C 和 200 rpm 孵育，直至 570 nm 处的光密度为 ~0.5 （OD₅₇₀）。
   3. 将OP50细菌培养物储存在4°C，并在两周内使用。
3. 用 OP50 细菌制备 NGM 板
   1. 将 20 g 琼脂、2.5 g 蛋白胨、3.0 g NaCl 和 975 mL 去离子水加入 1 L 可高压灭菌瓶中。在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   2. 将液体 NGM 琼脂瓶放在工作台上冷却至 ~60 °C，然后加入以下无菌储备溶液:1 mL 1 M CaCl₂、1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 5 mg/mL 胆固醇和 25 mL 1 M 磷酸钾 （pH 6.0）。
   3. 将 20 mL 的 NGM 倒入无菌的 90 mm 培养皿中，将板放在工作台上冷却和固化。将板倒置，让它们在室温下在工作台上干燥 2 天。
   将
   4. 200 μL 的 OP50 细菌培养物分配到每个 NGM 板上，并用无菌玻璃涂层棒均匀涂抹。盖上盖子，将板在 37 °C 下孵育过夜。
   5. 将用 OP50 接种的 NGM 板在室温下储存在带盖的塑料盒中，并在两周内使用。
4. 年龄同步的秀丽隐杆线虫种群的制备
   1. 将妊娠成虫收集到无菌的 1.5 mL 微量离心管中，并以 1000 × g 离心 1 分钟。洗涤 3 次，并将线虫重悬于 M9 缓冲液中。
   2. 加入等体积的漂白剂溶液，轻轻搅拌 3-5 分钟。在解剖显微镜下每 15 秒监测一次漂白情况。
      注意:漂白剂溶液必须在使用前通过混合等体积的 10% NaOCl 和 1 M NaOH 来新鲜制备（表 1）。
   3. 一旦大多数线虫被破坏，用 M9 缓冲液稀释以停止消化。快速离心以除去上清液，并将沉淀重悬于 M9 缓冲液中，重复洗涤 3 次。
   将
   4. 沉淀重悬于 S 培养基中。让线虫残渣在重力作用下沉降 2-3 分钟，而虫卵留在上清液中。
   5. 将上清液吸入新的无菌微量离心管中。通过在 1000 × g 离心 1 分钟来收集鸡蛋。
   6. 弃去 ~80% 的上清液，将鸡蛋转移到含有 20 mL S 培养基的无菌培养瓶中。将培养瓶放入摇床中，以 120 rpm 的转速在没有食物的情况下将鸡蛋孵育过夜，以获得同步的 L1 线虫。

2. PolyQ 介导的神经毒性检测

1. 用测试样品处理秀丽隐杆线虫
   1. 为了制备用于 polyQ 神经毒性测定的线虫，将 300-500 只同步的 HA759 L1 幼虫转移到含有 500 μL 含有 OP50（OD570 为 0.7-0.8）和 5 mg/mL 黄芪的 S 培养基的 48 孔板的每个孔中，通常每个处理三个重复孔。
   2. 用封口膜密封板，并在 15 °C 和 120 rpm 下孵育 3 天。
   3. 通过离心收集线虫，并用 M9 缓冲液洗涤 3-5 次。在 M9 缓冲液中重悬线虫，用于神经元存活和回避测定。
2. 渗透回避试验
   1. 通过中间的 8 M 甘油 （~30 μL） 线将无食物的 NGM 板 （9 cm） 分成正常 （N） 和捕获 （T） 区域。在距离甘油线 ~1 cm 处铺设一条 200 mM 叠氮化钠 （~20 μL） 线，以麻痹穿过甘油屏障进入 T 区的线虫。
   2. 将 ~200 个线虫每个转移到每组三个复制板的 N 区。在 T 区（距板边缘 1 cm）上加入一滴 1% 丁二酮 （~2 μL） 以吸引线虫。立即盖上培养皿的盖子，并在 23 °C 下孵育 90 分钟。
   3. 在显微镜下对 N 区和 T 区的线虫数量进行评分。使用 eq.
      计算回避指数 回避指数 = N / （T + N）
      其中 N 和 T 分别是 N 区和 T 区的线虫数量。数据以 3 次重复的标准差 （SD） 均值表示±代表 >3 个独立实验。
   4. 执行未配对的双尾 t 检验，以比较黄芪组和对照组的数据。

表 1:

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 溶液 制备说明 存储 1 M 氯化钙₂ 111 克氯化钙₂ 在室温 （RT） 下储存 将 dH₂O 添加到 1 L 中 高压 釜 1 M 磷酸钾 （pH 6.0） 108.3 克 KH₂PO₄ 存储在 RT 中 35,6 K₂HPO₄ 将 dH₂O 添加到 1 L 中 高压 釜 1 M MgSO₄ 246 克硫酸镁₄·7H₂O 存储在 RT 中 将 dH₂O 添加到 1 L 中 高压 釜 乙醇中的胆固醇 （5 mg/mL） 0.5 克 胆固醇 在 -20 °C 下储存 将乙醇加入 100 mL 不要高压灭菌！ 1 M 柠檬酸钾 （pH 6.0） 加入 10.0 g 柠檬酸一水合物 存储在 RT 中 添加 146.75 g 柠檬酸三钾一水合物 将 dH₂O 添加到 1 L 中 高压 釜 >痕量金属解决方案 0.93 克 EDTA 二钠 在 RT 中避光存储 0.345 克硫酸铁₄·7H₂O 0.1 克氯化锰₂·4H₂O 0.145 克硫酸锌₄·7H₂O 加入 0.0125 g CuSO₄·5H₂O 向 500 mL 中加入 dH₂O 高压 釜 1 M NaOH 4 克 NaOH 存储在 RT 中 向 100 mL 中加入 dH₂O 漂白剂溶液 0.5 mL 的 1 M NaOH 使用前请新鲜准备 0.5 毫升 10% NaOCl M9 缓冲区 5 克氯化钠 存储在 RT 3 克 KH₂PO₄ 6 克钠₂HPO₄ 将 dH₂O 添加到 1 L 中 高压 釜 加入 1 mL 的 1 M MgSO₄ >S 基础 5.85 克氯化钠 存储在 RT 6.0 克 KH₂PO₄ 1.0 克 K₂HPO₄ 向 973 mL 中加入 dH₂O 高压灭菌，并冷却至 ~60 °C 在乙醇中加入 1 mL 5 mg/mL 胆固醇 S 中等 S 基底 存储在 RT 加入 3 mL 的 1 M CaCl₂ 加入 3 mL 的 1 M MgSO₄ 加入 10 mL 1 M 柠檬酸钾 加入 10 mL 痕量金属溶液 所有组件均已高压灭菌，请勿高压灭菌 5 mg/mL 黄芪 0.1 克黄芪 在 -80 °C 下分装储存 加入 20 mL S 培养基 通过 0.22 μm 针式过滤器过滤 200 mM 叠氮化钠 1.3 克 NaN₃ 在 4 °C 下储存 加入 100 mL S 培养基 8 M 甘油 73.67 克甘油 存储在 RT 中 向 100 mL 中加入 dH₂O 10% 丁二酮原液 将 10 μL 丁二酮与 90 μL dH₂O 混合 储存在 RT 1% 丁二酮 将 10 μL 丁二酮原液添加到 90 μL dH₂O 中 储存在 RT 1 L 的 Luria-Bertani （LB） 培养物 10 克氯化钠 存储在 RT 中 10 克胰蛋白胨 5 克 酵母提取物 将 dH₂O 添加到 1 L 中 高压 釜

Materials