来源：Wang, Q. 等, Z. 利用秀丽隐杆线虫作为模型系统发现对抗多聚谷氨酰胺介导的神经毒性的生物活性化合物。视觉化实验杂志 (2021)。
本视频介绍了一种渗透压回避检测方法，用于研究转基因蠕虫模型中的趋化回避行为。在培养皿中，通过设置高渗透压屏障和化学趋化剂来检测蠕虫的回避行为。神经元功能缺失的蠕虫会被化学趋化剂吸引，穿越高渗透压屏障，并因麻醉溶液的作用而在陷阱区域发生麻痹。
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方法文章
利用渗透回避实验检测转基因蠕虫的避化疗行为 渗透回避实验, 避化疗行为, 转基因蠕虫, 神经行为学, Caenorhabditis elegans, 行为分析, 化学感应
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
注意：本方案中所用溶液的配方详见表1。
1. 线虫（Caenorhabditis elegans）实验材料的准备
- 维持 秀丽隐杆线虫 菌株
- 获取 秀丽隐杆线虫 （AM141 和 HA759）以及 大肠杆菌 （OP50 和 NA22）菌株（参见 材料表).
- 在接种了大肠杆菌OP50的线虫生长培养基（NGM）平板上培养线虫 E. coli OP50，AM141 在 20 °C 下培养，HA759 在 15 °C 下培养。
- 制备 E. coli OP50 菌株培养物
- 挑取单个菌落 E. coli 从LB划线平板中挑取OP50单菌落，接种于50 mL液体LB培养基中。
- 在37 °C、200 rpm条件下，将OP50细菌在摇床中培养至570 nm处光密度（OD）约为0.5570).
- 将OP50菌液在4 °C保存，并在两周内使用。
- NGM 平板的制备及接种 OP50 菌株
- 向1 L可高压灭菌瓶中加入20 g琼脂、2.5 g蛋白胨、3.0 g NaCl和975 mL去离子水。在121 °C下高压灭菌30 min。
- 将液体NGM琼脂瓶置于实验台上冷却至约60 °C，然后加入以下无菌储备溶液：1 mL 1 M CaCl₂2，1 mL 1 M MgSO₄45 mg/mL 胆固醇溶液 1 mL 和 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）25 mL
- 将20 mL NGM倒入无菌的90 mm培养皿中，置于实验台上冷却并凝固。将平板倒置，在室温下于实验台上干燥2天。
- 在每块NGM平板上加入200 µL OP50菌液，用无菌玻璃涂布棒均匀涂布。盖好平板，于37 °C过夜培养。
- 将接种了OP50的NGM平板置于带盖塑料盒中，室温保存，并在两周内使用。
- 年龄同步化样品的制备 秀丽隐杆线虫 种群
- 收集带有卵的成年线虫至无菌的1.5 mL微量离心管中，以1000 × g 孵育1分钟。用M9缓冲液洗涤三次，并将线虫重悬于M9缓冲液中。
- 加入等体积的漂白液，轻轻振荡3-5分钟。每隔15秒在解剖显微镜下观察一次漂白情况。
注意： 使用前需新鲜配制漂白液，将等体积的10% NaOCl与1 M NaOH混合（表1). - 当大部分线虫破裂后，加入M9缓冲液终止消化。迅速离心以去除上清液，并将沉淀重悬于M9缓冲液中，重复洗涤三次。
- 将沉淀重悬于S培养基中。静置2-3分钟，使线虫残渣依靠重力沉降，而虫卵保留在上清液中。
- 吸弃上清液至新的无菌微量离心管中。以1000 × g离心收集卵子。 g 1 分钟。
- 弃去约80%的上清液，将卵转移至含有20 mL S培养基的无菌烧瓶中。将烧瓶置于摇床中，在120 rpm条件下避光振荡培养过夜，以获得同步化的L1期线虫。
2. 多聚谷氨酰胺介导的神经毒性检测
- 治疗 秀丽隐杆线虫 与测试样品
- 为进行多聚谷氨酰胺（polyQ）神经毒性检测，将300–500条同步化的HA759 L1幼虫转移至48孔板的每个孔中，每孔加入500 µL含有OP50（OD570为0.7–0.8）和5 mg/mL黄芪多糖的S培养基，每种处理通常设三个重复孔。
- 用封口膜密封培养板，在15 °C、120 rpm条件下振荡培养3天。
- 通过离心收集线虫，并用M9缓冲液洗涤3–5次。将线虫重悬于M9缓冲液中，用于神经元存活和回避实验。
- 避渗实验
- 将无食物的NGM培养皿（9 cm）用中间一条8 M甘油（约30 µL）划线分为正常区（N）和陷阱区（T）。在距离甘油线约1 cm处涂抹一条200 mM叠氮化钠（约20 µL），用于麻痹穿过甘油屏障进入T区的线虫。
- 每组取三个重复平板，分别将约200条线虫转移至平板的N区。在T区（距平板边缘1 cm处）加入一滴1%丁二酮溶液（约2 µL），以吸引线虫。立即盖上培养皿盖，于23 °C孵育90分钟。
- 在显微镜下对N区和T区的线虫数量进行计数。利用公式eq计算回避指数。
回避指数 = N / (T + N)
其中N和T分别表示N区和T区的线虫数量。数据以三次重复实验的均值±标准差（SD）表示，具有代表性 >3 次独立实验。 - 进行非配对双尾检验 t采用 t 检验比较距骨素组与对照组的数据。
表1：
| 溶液 | 配制说明 | 储存条件 |
| 1 M CaCl2 | 111 g CaCl2 | 室温（RT）保存 |
| 加 dH2O 至 1 L | ||
| 高压灭菌 | ||
| 1 M 磷酸钾（pH 6.0） | 108.3 g KH2PO4 | 室温保存 |
| 35.6 g K2HPO4 | ||
| 加 dH2O 至 1 L | ||
| 高压灭菌 | ||
| 1 M MgSO4 | 246 g MgSO4·7H2O | 室温保存 |
| 加 dH2O 至 1 L | ||
| 高压灭菌 | ||
| 胆固醇乙醇溶液（5 mg/mL） | 0.5 g 胆固醇 | -20 °C 保存 |
| 加乙醇至 100 mL | ||
| 切勿高压灭菌！ | ||
| 1 M 柠檬酸钾（pH 6.0） | 加入 10.0 g 一水柠檬酸 | 室温保存 |
| 加入 146.75 g 一水三柠檬酸钾 | ||
| 加 dH2O 至 1 L | ||
| 高压灭菌 | ||
| 微量元素溶液 | 0.93 g 乙二胺四乙酸二钠 | 避光、室温保存 |
| 0.345 g FeSO4·7H2O | ||
| 0.1 g MnCl2·4H2O | ||
| 0.145 g ZnSO4·7H2O | ||
| 加入 0.0125 g CuSO4·5H2O | ||
| 加 dH2O 至 500 mL | ||
| 高压灭菌 | ||
| 1 M NaOH | 4 g NaOH | 室温保存 |
| 加 dH2O 至 100 mL | ||
| 漂白液 | 0.5 mL 1 M NaOH | 使用前新鲜配制 |
| 0.5 mL 10% NaOCl | ||
| M9 缓冲液 | 5 g NaCl | 室温保存 |
| 3 g KH2PO4 | ||
| 6 g Na2HPO4 | ||
| 加 dH2O 至 1 L | ||
| 高压灭菌 | ||
| 加入 1 mL 1 M MgSO4 | ||
| S 基础培养基 | 5.85 g NaCl | 室温保存 |
| 6.0 g KH2PO4 | ||
| 1.0 g K2HPO4 | ||
| 加 dH2O 至 973 mL | ||
| 高压灭菌，冷却至约 60 °C | ||
| 加入 1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液 | ||
| S 培养基 | S 基础培养基 | 室温保存 |
| 加入 3 mL 1 M CaCl2 | ||
| 加入 3 mL 1 M MgSO4 | ||
| 加入 10 mL 1 M 柠檬酸钾 | ||
| 加入 10 mL 微量元素溶液 | ||
| 所有组分均已高压灭菌，切勿再次高压灭菌 | ||
| 5 mg/mL 黄芪多糖 | 0.1 g 黄芪多糖 | 分装后于 -80 °C 保存 |
| 加入 20 mL S 培养基 | ||
| 经 0.22 μm 注射器滤器过滤 | ||
| 200 mM 叠氮化钠 | 1.3 g NaN3 | 4 °C 保存 |
| 加入 100 mL S 培养基 | ||
| 8 M 甘油 | 73.67 g 甘油 | 室温保存 |
| 加 dH2O 至 100 mL | ||
| 10% 丁二酮储备液 | 将 10 μL 丁二酮与 90 μL dH2O 混合 | 室温保存 |
| 1% 丁二酮 | 将 10 μL 丁二酮储备液加入 90 μL dH2O 中 | 室温保存 |
| 1 L 营养肉汤（LB）培养液 | 10 g NaCl | 室温保存 |
| 10 g 胰蛋白胨 | ||
| 5 g 酵母提取物 | ||
| 加 dH2O 至 1 L | ||
| 高压灭菌 |
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 秀丽隐杆线虫 品系 | |||
| HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)] | 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（CGC） | https://cgc.umn.edu/strain/HA759 | |
| E. coli 品系 | |||
| NA22 | 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（CGC） | https://cgc.umn.edu/strain/NA22 | |
| OP50 | 秀丽隐杆线虫 遗传学中心（CGC） | https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 试剂 | |||
| 琼脂 | 上海颐坤生物技术有限公司 | EQ1001-500G | https://www.ekear.com |
| 丁二酮 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80042427 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0 |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | C8667 | https://www.sigmaaldrich.com/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product |
| 甘油 | Aladdin Co., Ltd. | G116203 | https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html |
| 蛋白胨 | 广东环凯微生物科技有限公司 | 050170B | https://www.huankai.com/show/21074.html |
| 叠氮化钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80115560 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd |
| 氢氧化钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10019718 | https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6 |
| 次氯酸钠溶液 | 广州化学试剂厂 | 7681-52-9 | http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125 |
| 胰蛋白胨 | Oxoid Ltd. | LP0042B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B |
| 酵母提取物 | Oxoid Ltd. | LP0021B | https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B |
| 设备 | |||
| 48孔细胞培养板 | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | https://www.cell-nest.com/page94?_l=zh&product_id=85 |
| 90 mm 培养皿 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F611003 | https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003 |
| 高压灭菌 | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| 解剖显微镜 | ChongQing Optical Co., Ltd. | ZSA0745 | http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 |
| 微量离心机 | GeneCompany | GENESPEED X1 | https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/CN/zh/product/sigma/p7793?context=product |
| 摇床 | Zhicheng Inc. | ZWY-2102C | http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html |
