共培养条件下评估小鼠成肌细胞迁移能力的伤口愈合实验

摘要

来源：Toubat, O. 等人， 模拟旁分泌非经典Wnt信号通路 体外. 视频实验杂志 (2021).

本视频介绍了一种非接触式共培养伤口愈合检测方法，用于评估小鼠成肌细胞的迁移能力。该方法有助于理解旁分泌非经典Wnt信号通路相互作用中的信号发送与信号接收组分。 体外

方案

1. 伤口愈合实验：

（图1 概述了该检测方法的示意图模型）

1. 让O9-1细胞插入物和C2C12细胞培养室小室在培养箱中贴壁并增殖，直至两种细胞均达到约70–80%汇合度，再进行本实验步骤。若细胞生长 >细胞融合度达到90%时，不要进行划痕实验，否则细胞会从孔壁脱落。
2. 将1×PBS和C2C12培养基置于37 °C水浴中预热。
3. 从 C2C12 培养室小孔中移除上清液，并用 1x PBS 洗涤细胞一次。吸除 1x PBS，立即使用无菌 P10 移液枪头划线刮伤细胞。
   1. 用无菌的P10枪头以单向用力的方式划过细胞单层的整个长度或宽度（例如从右到左、从上到下）。确保每个含细胞的孔仅划一次。
      注意： 为获得最佳划痕效果，应在相似的细胞融合度下对不同实验条件的孔进行划痕。为此，请确保每个四孔板中的每个孔均含有对应各实验条件的细胞（例如，1号孔为阴性对照，2号孔为阳性对照）。此外，每次划痕均应使用新的无菌P10移液枪头，并以相似的力度施加于移液器。每个孔内不得进行多次划痕。
   2. 划痕后，立即使用 P1000 移液器吸头向孔中加入 1 mL 1×PBS。对需要划痕的每个孔重复此操作。
      注意： 鉴于每个划痕存在差异性，建议在每个实验条件下使用多个孔（n = 3）进行伤口创建。操作应迅速进行，因为在这些步骤中必须尽量缩短细胞脱离1x PBS的时间。在从每个孔中移除1x PBS后，应在不超过5秒的时间内完成每个孔的伤口制作。
4. 在制造伤口并重新加入1×PBS至每个孔后，使用倒置明场显微镜对划痕进行成像，并将此图像作为伤口初始大小的基线（0时间点）。进行成像时，请执行以下步骤：
   1. 打开计算机和显微镜（参见 材料表) 按下电源按钮启动设备。将腔室载玻片放置在载物台上，旋转物镜转盘至5倍放大倍数。
   2. 打开成像软件（参见 材料表) 通过双击计算机桌面上的软件图标启动。点击 相机 软件主界面上的标签。点击 活体 按钮以可视化细胞 AxioCam IC 表。
   3. 确保将光滤镜完全拉出，以允许光线通过至相机和计算机屏幕。手动移动和/或旋转腔室载玻片，使伤口区域位于实时图像的中央 AxioCam IC 表。
   4. 要拍摄图像，请单击 快照 打开一个 新 标签旁边的下一个 AxioCam IC 包含图像的标签页
   5. 要保存此静态图像，请单击 文件 在软件主页的左上角 | 另存为 | 输入 文件名 在文件名框中。将图像保存为 Carl Zeiss 图像（*.czi）格式（默认设置），并选择 桌面 在左侧的工具栏上点击以将文件保存到桌面为 .czi 文件，该文件仅可在 Zen lite 2012 软件程序中打开。
   6. 要将图片另存为 .tiff 格式，请单击 文件 | 另存为 | 进入 文件名 在文件名框中。将图形另存为标记图像文件 (*.tiff) 通过点击 保存类型 按钮并选择 *.tiff 从下拉菜单中。
      注意： .tiff 格式可在任何图像处理软件中打开。
   7. 手动重新定位腔室载玻片，在同一孔中伤口的其他位置再采集2-3张图像。
      注意： 总共将获得每个孔中3-4张不重叠的高倍显微图像。
5. 吸除每孔中的1×PBS，加入1 mL C2C12培养基。
   注意： 在伤口生成后向小室孔中移除或添加溶液时，应注意不要过于剧烈地移液，以免导致细胞从小室孔中脱落。此外，应倾斜小室孔，使溶液的吸取和重新加入可在每个孔的角落进行，以尽量减少对细胞单层的干扰。
6. 将含有 O9-1 细胞的插件手动放入培养板各孔中，构建小室插件共培养系统。轻轻下压插件，使其底部刚好位于下方 C2C12 细胞的上方。将小室插件结构放回培养箱中继续培养。
   注意： 切勿让插入物的底部直接接触并机械性破坏下方的C2C12细胞。
7. 让细胞迁移总共 9–12 小时。为确定最佳迁移时间，可在划痕后 6 小时首次观察细胞，之后每隔 2–3 小时观察一次。当对照组或阳性对照组的细胞开始完全覆盖划痕区域时，结束实验。
   注意： 由于该构建体具有非接触特性，在观察间歇性迁移进程时，无需从孔中取出上层插入物。迁移的变异性将取决于多种因素，例如本实验所用的细胞类型、创面生成时的细胞密度、所创建创面的宽度，以及对细胞进行操作的实验条件（如基因敲低、添加重组蛋白等）。这些试剂的浓度应根据制造商的建议，并通过实验优化确定。

结果

图1：检测方法的示意图模型。 步骤1包括 体外 使用STO饲养层细胞扩增C2C12成肌细胞和NCCs。第二步涉及在共培养系统中接种NCCs和C2C12细胞。第三步包括对底层C2C12细胞进行划痕实验，以评估细胞迁移能力。第四步包括对迁移细胞进行鬼笔环肽免疫荧光染色，以评估其细胞骨架结构和形态。缩写：NCCs = 神经嵴细胞；Ab = 抗体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C2C12 小鼠成肌细胞系 	ATCC	CRL-1772
4 孔腔室载玻片系统	ThermoFisher Scientific	154526
高糖（4.5 g/L）含 L-谷氨酰胺（2 mM）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）’’ 	Corning	10-017-CV	4 °C 保存
10 µL 无菌刻度移液器吸头	USA Scientific	1111-3810
O9-1 神经嵴细胞系 	Millipore Sigma	SCC049
不含钙和镁、pH 7.4 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-040-CV	4 °C 保存
带 0.4 µm 透明 PET 膜的 24 孔板用 Falcon 可渗透支持膜	Corning	353095
胎牛血清	Fisher Scientific 	W3381E	-20 °C 以 50 mL 分装保存
Zeiss Axio Vert.A1 倒置光学显微镜	Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 显微成像软件	Carl Zeiss AG		成像软件