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酶联免疫吸附测定法验证化学偶联的抗体-抗原结合物

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Volckmar, J. 等人， 靶向小鼠树突状细胞的纯化抗DEC-205抗体与全长蛋白的化学偶联 体外 和 体内 视频实验杂志 (2021)

本视频展示了化学偶联的抗体-抗原复合物的检测方法 通过 夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）技术。捕获抗体结合抗体-抗原复合物中抗原的特异性表位，随后可通过酶标记的二抗进行可视化检测。

方案

1. 从杂交瘤细胞系 NLDC-145 生产 αDEC-205

  1. 为制备抗体，将冻存的NLDC-145细胞（分泌αDEC-205）在37 °C水浴中解冻。在37 °C、5% CO2条件下扩增细胞。进行抗体生产需要两个75 cm2 的培养瓶。细胞培养操作应在生物安全柜中进行，以确保操作安全并防止培养物污染。
    1. 将1 mL解冻后的细胞（1 × 106 - 5 × 106 个细胞/mL）重悬于9 mL ISF-1培养基中，该培养基需添加1%青霉素/链霉素（预热至37 °C），并转移至细胞培养瓶（25 cm2）中。将培养瓶水平放置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。
    2. 在37 °C、5% CO2条件下培养细胞，直至细胞融合度达到70%。通常在24 - 48小时内可达到此状态。
    3. 当细胞融合度达到70%时，使用1-10 mL量程的移液器配合移液控制器，将全部NLDC-145细胞悬液（10 mL）转移至15 mL圆锥形离心管中。在室温下以250 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
    4. 将ISF-1培养基在水浴中预热至37 °C，用12 mL添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基重悬细胞沉淀。将重悬后的细胞悬液转移至一个新的细胞培养瓶（75 cm2）中。
    5. 在添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基中，于37 °C、5% CO2条件下继续培养并扩增细胞，直至细胞融合度达70%且活率高达99%。通常在48 - 72小时内可达到此状态。
    6. 将细胞分种至两个75 cm2培养瓶中。操作时，先用细胞悬液冲洗细胞培养瓶底部/培养表面，以彻底去除所有NLDC-145细胞。将6 mL NLDC-145细胞悬液分别转移至两个新的75 cm2培养瓶中，并加入预热的添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基，补至总体积12 mL。
      注意：不要更换培养基，因为NLDC-145细胞已对培养基进行了条件化处理。应将细胞连同原有培养基一起转移，并用新鲜培养基补足至所需体积。这对维持细胞活力及实现NLDC-145细胞最大抗体产量至关重要。
    7. 在37 °C、5% CO2条件下继续扩增细胞培养物，直至融合度约达70%，通常在48 - 72小时内可达到此状态。
    8. 当细胞融合度达到70%时，从每个75 cm2培养瓶中取10 mL扩增后的NLDC-145细胞悬液，转移至一个PETG（聚对苯二甲酸乙二醇酯-共-乙二醇）滚瓶（1,050 cm2）中。操作时，使用移液控制器和10 mL移液器，以细胞悬液冲洗细胞培养瓶底部/培养表面，确保将所有细胞从表面洗脱。
    9. 直接从培养基瓶中取出140 mL添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基（预热至37 °C），加入每个含NLDC-145细胞的滚瓶中，使液体体积达到150 mL刻度线。
      注意：参见步骤1.1.6中的说明。
    10. 在37 °C、5% CO2、转速25转/分钟的条件下培养滚瓶，持续三天。
    11. 向每个含NLDC-145细胞的滚瓶中加入150 mL添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基（预热至37 °C），使液体体积达到300 mL刻度线。
    12. 将每个含300 mL培养物的滚瓶在37 °C、5% CO2、转速25转/分钟的条件下继续培养三天。
    13. 向每个含NLDC-145细胞的滚瓶中再加入100 mL添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基（预热至37 °C），使液体体积达到400 mL刻度线。
    14. 将每个含400 mL培养物的滚瓶在37 °C、5% CO2、转速25转/分钟的条件下继续培养七天。
      注意：在此周期间，培养物变得非常浓密（密度可达95%），细胞活力下降（可低至50%），从而促进抗体的最大释放。
  2. 从培养上清中纯化αDEC-205时，将两个滚瓶中的NLDC-145细胞悬液直接倒入500 mL灭菌离心瓶中。
    注意：应共收集约800 mL培养液。
    1. 在4 °C、8,600 × g条件下离心30分钟，以去除细胞及碎片。
    2. 收集上清液，弃去沉淀，并将上清液汇集至无菌试剂瓶中。
      注意：可立即开始αDEC-205的纯化（步骤2），或短期将上清液保存于4 °C。

2. 从 NLDC-145 细胞上清液中纯化 αDEC-205 抗体

注意：从 NLDC-145 细胞上清液中，使用蛋白 G Sepharose 柱（可重复使用）纯化 αDEC-205。柱尺寸为 15 mm × 74 mm，每根柱中装填 5 mL 蛋白 G Sepharose。

  1. 准备和清洗蛋白G Sepharose柱时，将一个密封的橡胶塞安装在蛋白G Sepharose柱的上端开口处。用两根无菌套管（20 G × 1 1/2"，0.90 × 40 mm）穿刺橡胶塞。
    1. 将一个10 mL注射器连接至其中一根套管，另一根套管则连接一段长约100 cm、直径为2.5–3 mm的柔性硅胶管，并使用管路连接器固定。
      注意：该注射器/橡胶塞装置可重复使用，通过产生负压，使大量培养上清液持续流入蛋白G Sepharose柱。为此，在后续操作中应轻微回拉注射器活塞，以确保液体持续流动。
    2. 用50 mL 0.1 M冰乙酸（pH 2）清洗柱子，以去除前次抗体纯化过程中可能残留的抗体。将硅胶管末端插入盛有0.1 M冰乙酸（pH 2）的试剂瓶中。在负压作用下，50 mL 0.1 M冰乙酸（pH 2）将逐滴通过蛋白G Sepharose柱。
      注意：0.1 M冰乙酸（pH 2）应储存于试剂瓶中，或新鲜配制后倒入烧杯中使用。
    3. 用100–200 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗柱子。将硅胶管末端插入盛有PBS的试剂瓶或烧杯中，使100–200 mL PBS逐滴通过蛋白G Sepharose柱。
  2. 从NLDC-145上清液中纯化抗体时，将800 mL NLDC-145上清液（来自步骤1.2.2）加载至柱子中。将硅胶管末端插入盛有NLDC-145上清液的试剂瓶中，使800 mL上清液逐滴通过柱子。
    1. 用500 mL PBS清洗柱子。将硅胶管末端插入盛有PBS的试剂瓶或烧杯中，使500 mL PBS逐滴通过柱子。
    2. 洗脱时，准备20个1.5 mL离心管，每管中加入100 µL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）。取下柱子上的橡胶塞，向蛋白G Sepharose柱的上样室加入1 mL 0.1 M甘氨酸（pH 3），以洗脱结合的抗体。直接收集流出液至已准备好的1.5 mL离心管中作为洗脱液。
    3. 对全部20个1.5 mL离心管重复洗脱步骤（2.2.2）。
    4. 使用分光光度计测定所有洗脱组分在280 nm处的光密度（OD280），以确定含抗体的组分。
      注意：以第一个洗脱组分作为空白对照。
    5. 合并所有OD280大于0.5的组分（约10个组分）。
    6. 将蛋白G Sepharose柱用20%乙醇填充后，于4 °C保存。
  3. 使用截留分子量（MWCO）为12–14 kDa的透析袋，在4 °C条件下将合并的洗脱液对1000 mL PBS（置于2000 mL烧杯中）透析过夜。
    1. 将透析袋剪成20 cm长的片段。在烧杯中加入500–800 mL 10 mM EDTA（pH 7.5），将透析袋放入其中，使用加热板煮沸30分钟以去除污染物。弃去10 mM EDTA（pH 7.5）溶液，再将透析袋在去离子水中煮沸10分钟。
      注意：透析袋可立即使用，或储存于含0.01%叠氮化钠（NaN3）/H2O的溶液中，4 °C保存以备后续使用。
    2. 使用合适的透析袋夹具或单片铰链夹封闭透析袋底部，小心地将抗体洗脱液用移液器加入透析袋内，再用第二个夹子封闭顶部。
    3. 将透析袋上端的夹子固定在浮架上，连同磁力搅拌子一起放入盛有PBS的烧杯中，并将烧杯置于磁力搅拌器上。
    4. 在4 °C下持续搅拌透析过夜。
  4. 为提高αDEC-205的浓度，将全部透析液转移至截留分子量为10 kDa的离心浓缩管中。打开透析袋的一端夹子，小心地将全部透析液从透析袋中移出，加入离心浓缩管（10 kDa MWCO）中。
    注意：移液时切勿使移液器吸头接触浓缩管底部。
    1. 在693 × g（2,000 rpm）和4 °C条件下离心30分钟。
    2. 向离心浓缩管中加入10 mL PBS，继续在693 × g（2,000 rpm）和4 °C条件下离心，直至抗体溶液最终体积为1–1.5 mL。
      注意：如有需要，可重复步骤2.4.1的离心操作，以调整至目标体积。
    3. 使用分光光度计测定浓缩后的αDEC-205溶液在280 nm处的光密度（OD280），以PBS为空白对照。
    4. 使用以下公式计算αDEC-205的浓度：
      浓度 [mg/mL] = OD280/1.4。
    5. 使用0.22 µm注射式滤器对αDEC-205溶液进行过滤。
      注意：αDEC-205也可通过FPLC（快速蛋白液相色谱）从NLDC-145杂交瘤细胞上清液中纯化。纯化后的αDEC-205可于4 °C短期保存，或于-18 °C长期保存。

3. OVA 与 αDEC-205 的化学偶联

注意：为实现最佳化学偶联，OVA 蛋白与 αDEC-205 的比例需为 0.5 mg : 2.5 mg（1:5）。然而，该比例可能因其他蛋白或抗体而异，需针对不同的偶联物进行优化。OVA 蛋白的二硫键通过与 30 mM TCEP-HCl 孵育进行还原，从而暴露巯基，用于与 αDEC-205 的化学偶联，步骤 3.2 中需要 240 µl TCEP-HCl。TCEP 诱导的 OVA 还原（步骤 3.1）和 sulfo-SMCC 活化 αDEC-205（步骤 3.2）两个步骤建议同时进行。

  1. 新鲜配制 125 mM TCEP-HCl 溶液（pH 7.0）。称取所需量的 TCEP-HCl，并将其溶解于 0.9 M Tris 碱（pH 8.8）中。使用 pH 指示试纸检测 125 mM TCEP-HCl 溶液的 pH 值（应为中性），并用 Tris 碱（pH 8.8）调节 pH。
    1. 用移液器将 200 µL OVA 蛋白溶液（含 0.5 mg OVA）加入一个 1.5 mL 无菌离心管中。向该 OVA 蛋白溶液中加入 240 µL 125 mM TCEP-HCl 和 560 µL 无菌超纯水，最终得到 OVA 蛋白浓度为 0.5 mg/mL、TCEP-HCl 浓度为 30 mM 的溶液（OVA/TCEP-HCl）。
      注意： 2.5 mg EndoGrade OVA（冻干粉）溶于 1 mL PBS 中，配制成 2.5 mg/mL 的 OVA 溶液。
    2. 将所得的 OVA/TCEP-HCl 溶液在室温下孵育 1.5 小时。
      注意： 不得延长此孵育步骤。
  2. 为活化 αDEC-205 以进行偶联，将 2 mg sulfo-SMCC 溶解于 100 µL 超纯水中。
    注意： sulfo-SMCC 易发生水解，因此未溶解的 sulfo-SMCC 应快速操作，或使用预先分装好的 2 mg 份量。
    1. 用 PBS 稀释 αDEC-205，使 2.5 mg αDEC-205 溶于 900 µL 体积中。
    2. 将 2.5 mg αDEC-205（900 µL，来自步骤 3.2.1）与 100 µL sulfo-SMCC（来自步骤 3.2）在 1.5 mL 离心管中混合，总体积为 1 mL。
    3. 将 αDEC-205/sulfo-SMCC 溶液置于加热块中，在 37 °C、550 rpm 条件下孵育 30 分钟。
  3. 完成上述孵育后，立即使用脱盐柱（分子截留量 7 kDa；柱体积 5 mL）从溶液中去除过量的 sulfo-SMCC 和 TCEP-HCl。
    1. 拧下脱盐柱（分子截留量 7 kDa）底部封盖，松开顶部盖子，并将柱子放入一个 15 mL 圆锥形离心管中。
    2. 在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟，去除柱内液体。
    3. 将柱子转移至新的离心管中，打开盖子。分别将抗体/sulfo-SMCC 溶液和 OVA/TCEP-HCl 溶液缓慢加样至两个脱盐柱的树脂床中心。
    4. 在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟。
    5. 使用后丢弃脱盐柱。含有已准备偶联的抗体和 OVA 的溶液保留在离心管中。
    6. 立即用移液器混合上述两种溶液，以实现 αDEC-205 与 OVA 的偶联。
    7. 将所得的 αDEC-205 与 OVA 混合液在 4°C 下过夜孵育。
  4. 偶联完成后，使用离心式蛋白浓缩器（分子截留量 150 kDa）去除溶液中未结合的过量 OVA，并浓缩偶联产物 αDEC-205/OVA。
    1. 用移液器向浓缩器中加入 12 mL PBS，在室温下以 2,000 × g 离心 2 分钟，对离心式蛋白浓缩器（分子截留量 150 kDa）进行预冲洗。
      注意： 如有必要，重复此离心步骤（3.4.1）直至约 5 mL 液体通过浓缩器。
    2. 在将 αDEC-205/OVA 加载到离心式蛋白浓缩器之前，保留 20 µL 未浓缩的 αDEC-205/OVA 样品用于 Western blot 分析。将该样品分装后于 4 °C 保存至分析时使用。
    3. 用移液器将 αDEC-205/OVA 加载至离心式蛋白浓缩器中。
      注意： 避免与浓缩器上室的滤膜床接触。
    4. 用 PBS 将浓缩器补至 15 mL，在室温下以 2,000 × g 离心 5 分钟。
    5. 保留穿流液样品（穿流液 I）用于 Western blot 分析，其余穿流液弃去。
    6. 用 PBS 将浓缩器补至 10 mL，在室温下以 2,000 × g 离心至少 8 分钟。
    7. 保留第二次穿流液样品（穿流液 II）用于 Western blot 分析，其余穿流液弃去。
    8. 当达到所需浓缩程度时（上室中剩余约 1.5 mL αDEC-205/OVA 溶液），轻柔吸取浓缩后的样品。
      注意： 若上室中残留液体过多，可重复离心，但应尽可能缩短离心时间。
  5. 使用微量分光光度计测定所得 αDEC-205/OVA 的蛋白浓度。以 PBS 作为空白对照。
  6. 使用 0.22 µm 注射式滤器对 αDEC-205/OVA 进行过滤。
    注意： 用于后续分析和 体内 实验时，αDEC-205/OVA 可在 4 °C 或 -18 °C 下保存。

4. 通过 ELISA 验证化学偶联

  1. 通过 ELISA 进一步验证化学偶联成功，获得 αDEC-205/OVA。
  2. 用包被缓冲液（0.1 M 碳酸氢钠（NaHCO3）pH 9.6，溶于 H2O）将 3 ng/µL 兔抗 OVA 抗体以每孔 100 µL 的量包被至适当的 96 孔 ELISA 板中。
    1. 4 °C 下孵育过夜。
  3. 包被完成后，用 PBS 洗涤板三次，例如使用 ELISA 洗板机。
  4. 每孔加入 200 µL 封闭缓冲液（含 10% FCS 的 PBS），用移液器加样，室温孵育 30 分钟以封闭板孔。
  5. 将步骤 3.6 获得的 αDEC-205/OVA 用封闭缓冲液（含 10% FCS 的 PBS）按 1:2 比例进行系列稀释，获得从 6 µg/mL 至 93.8 ng/mL 的 αDEC-205/OVA 稀释液，并向各孔中加入 100 µL/well 的上述梯度稀释样品。
    1. 室温孵育 1 小时。
  6. 用 PBS 洗涤板三次，例如使用 ELISA 洗板机。
  7. 向每孔加入 100 µL 辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠 IgG+IgM(H+L) 抗体（用封闭缓冲液（含 10% FCS 的 PBS）稀释至 1:2,000）。
    1. 室温孵育 1 小时。
  8. 用 PBS 洗涤板三次，例如使用 ELISA 洗板机。
  9. 向孔中加入 50 µL HRPO 底物溶液。当观察到明显的显色反应时，每孔加入 150 µL 终止液（1 M H2SO4）终止反应。
  10. 5 分钟后，使用 ELISA 读板仪在 450 nm 波长下读取吸光度。

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披露

未声明任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
封闭缓冲液（ELISA）含10% FBS的PBS
细胞培养瓶 T25Greiner Bio-One690175我们使用标准的CELLSTAR带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（690195）
细胞培养瓶 T75Greiner Bio-One658175我们使用标准的CELLSTAR 带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（658195） 
细胞培养瓶 T175Greiner Bio-One661175我们使用标准的CELLSTAR带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（661195）
超滤离心浓缩管，截留分子量10 kDaSartoriusVS2001Vivaspin 20 超滤离心浓缩管
超滤蛋白浓缩管，截留分子量100 kDa，5–20 mlThermo Fisher Scientific88532Pierce蛋白浓缩管，PES材质，5–20 ml；我们曾使用Pierce浓缩管150K，截留分子量20 mL（货号89921），但该产品目前已停产 
离心瓶Nalgene525-2314聚丙烯共聚物（PPCO）材质，带聚丙烯（PP）螺旋盖，500 ml；购自德国VWR
包被缓冲液（ELISA）0.1 M 碳酸氢钠（NaHCO₃）水溶液（pH 9.6）
脱盐柱，截留分子量7 kDaThermo Fisher Scientific89891Thermo Scientific Zeba Spin 脱盐柱，7K 截留分子量，5 mL
ELISA检测试剂（HRPO底物）Sigma-Aldrich/MerckT8665-100ML3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统
ELISA 96孔板Thermo Fisher Scientific442404MaxiSorp Nunc-Immuno 板
胎牛血清PAN-BIOtechP40-47500FBS Good forte
ISF-1培养基Biochrom/bioswisstecF 9061-01
NLDC-145杂交瘤细胞ATCCHB-290若无现成细胞，可从ATCC获取该杂交瘤细胞
卵清蛋白Hyglos（通过BioVendor）321000EndoGrade OVA 超纯，内毒素含量 <0.1 EU/mg
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific15140122Gibco 青霉素/链霉素，10,000 U/ml；也可选用Gibco 青霉素/链霉素，5,000 U/ml（15070-063）
PETG聚对苯二甲酸乙二醇酯-共聚-乙二醇细胞培养滚瓶Nunc In Vitro734-2394标准PDL包被，带通气孔（1.2X），表面积1050 cm²，容积100–500 ml；购自德国VWR  
pH指示试纸Merck109535pH指示试纸 0–14
多克隆山羊抗大鼠IgG+IgM-HRPO抗体α （ELISA）Jackson ImmunoResearch 112-035-068购自德国Dianova；ELISA中使用稀释比例为1:2000
多克隆兔抗OVA抗体α（ELISA）Abcamab181688使用浓度为3 ng/µl
Protein G Sepharose层析柱Merck/MilliporeP3296将5 ml Protein G Sepharose Fast Flow填料装入空柱PD-10（Merck，货号GE 17-0435-01）
橡胶塞Omnilab5230217DEUTSCH & NEUMANN橡胶塞（下端直径Φ 17 mm；上端直径Φ 22 mm）
硅胶管Omnilab5430925DEUTSCH & NEUMANN（内径Φ 1 mm；外径Φ 3 mm）
Slim-Fast我们在该蛋白印迹实验中使用了药店可购得的普通Slim-Fast巧克力，其效果优于奶粉
终止液（ELISA）1 M H₂SO₄
Sulfo-SMCCThermo Fisher Scientific22322Pierce Sulfo-SMCC交联剂；也可使用货号A39268（10 × 2 mg）
0.22 µm针头式滤器 Merck/MilliporeSLGV033RSMillex-GV针头式滤器，0.22 µm，PVDF材质，33 mm，经γ射线灭菌 
10 ml注射器Omnilab一次性注射器 Injekt® Solo B.Braun
Sterican®穿刺针B. BraunSterican® G 20 x 1 1/2""；0.90 x 40 mm；黄色
TCEP-HClThermo Fisher ScientificA35349
管路连接器OmnilabKleinfeld微型管路连接器，用于硅胶管

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ELISA DEC 205

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