酶联免疫吸附测定法验证化学偶联的抗体-抗原结合物

摘要

来源：Volckmar, J. 等人， 靶向小鼠树突状细胞的纯化抗DEC-205抗体与全长蛋白的化学偶联 体外 和 体内 视频实验杂志 (2021)

本视频展示了化学偶联的抗体-抗原复合物的检测方法 通过 夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）技术。捕获抗体结合抗体-抗原复合物中抗原的特异性表位，随后可通过酶标记的二抗进行可视化检测。

方案

1. 从杂交瘤细胞系 NLDC-145 生产 αDEC-205

1. 为制备抗体，将冻存的NLDC-145细胞（分泌αDEC-205）在37 °C水浴中解冻。在37 °C、5% CO₂条件下扩增细胞。进行抗体生产需要两个75 cm² 的培养瓶。细胞培养操作应在生物安全柜中进行，以确保操作安全并防止培养物污染。
   1. 将1 mL解冻后的细胞（1 × 10⁶ - 5 × 10⁶ 个细胞/mL）重悬于9 mL ISF-1培养基中，该培养基需添加1%青霉素/链霉素（预热至37 °C），并转移至细胞培养瓶（25 cm²）中。将培养瓶水平放置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中。
   2. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞，直至细胞融合度达到70%。通常在24 - 48小时内可达到此状态。
   3. 当细胞融合度达到70%时，使用1-10 mL量程的移液器配合移液控制器，将全部NLDC-145细胞悬液（10 mL）转移至15 mL圆锥形离心管中。在室温下以250 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
   4. 将ISF-1培养基在水浴中预热至37 °C，用12 mL添加了1%青霉素/链霉素的ISF-1培养基重悬细胞沉淀。将重悬后的细胞悬液转移至一个新的细胞培养瓶（75 cm²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
封闭缓冲液（ELISA）			含10% FBS的PBS
细胞培养瓶 T25	Greiner Bio-One	690175	我们使用标准的CELLSTAR带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（690195）
细胞培养瓶 T75	Greiner Bio-One	658175	我们使用标准的CELLSTAR 带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（658195）
细胞培养瓶 T175	Greiner Bio-One	661175	我们使用标准的CELLSTAR带滤膜瓶盖细胞培养瓶；也可选用悬浮培养瓶（661195）
超滤离心浓缩管，截留分子量10 kDa	Sartorius	VS2001	Vivaspin 20 超滤离心浓缩管
超滤蛋白浓缩管，截留分子量100 kDa，5–20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce蛋白浓缩管，PES材质，5–20 ml；我们曾使用Pierce浓缩管150K，截留分子量20 mL（货号89921），但该产品目前已停产
离心瓶	Nalgene	525-2314	聚丙烯共聚物（PPCO）材质，带聚丙烯（PP）螺旋盖，500 ml；购自德国VWR
包被缓冲液（ELISA）			0.1 M 碳酸氢钠（NaHCO₃）水溶液（pH 9.6）
脱盐柱，截留分子量7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Thermo Scientific Zeba Spin 脱盐柱，7K 截留分子量，5 mL
ELISA检测试剂（HRPO底物）	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）液体底物系统
ELISA 96孔板	Thermo Fisher Scientific	442404	MaxiSorp Nunc-Immuno 板
胎牛血清	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Good forte
ISF-1培养基	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
NLDC-145杂交瘤细胞	ATCC	HB-290	若无现成细胞，可从ATCC获取该杂交瘤细胞
卵清蛋白	Hyglos（通过BioVendor）	321000	EndoGrade OVA 超纯，内毒素含量 <0.1 EU/mg
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco 青霉素/链霉素，10,000 U/ml；也可选用Gibco 青霉素/链霉素，5,000 U/ml（15070-063）
PETG聚对苯二甲酸乙二醇酯-共聚-乙二醇细胞培养滚瓶	Nunc In Vitro	734-2394	标准PDL包被，带通气孔（1.2X），表面积1050 cm²，容积100–500 ml；购自德国VWR
pH指示试纸	Merck	109535	pH指示试纸 0–14
多克隆山羊抗大鼠IgG+IgM-HRPO抗体α （ELISA）	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	购自德国Dianova；ELISA中使用稀释比例为1:2000
多克隆兔抗OVA抗体α（ELISA）	Abcam	ab181688	使用浓度为3 ng/µl
Protein G Sepharose层析柱	Merck/Millipore	P3296	将5 ml Protein G Sepharose Fast Flow填料装入空柱PD-10（Merck，货号GE 17-0435-01）
橡胶塞	Omnilab	5230217	DEUTSCH & NEUMANN橡胶塞（下端直径Φ 17 mm；上端直径Φ 22 mm）
硅胶管	Omnilab	5430925	DEUTSCH & NEUMANN（内径Φ 1 mm；外径Φ 3 mm）
Slim-Fast			我们在该蛋白印迹实验中使用了药店可购得的普通Slim-Fast巧克力，其效果优于奶粉
终止液（ELISA）			1 M H₂SO₄
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Pierce Sulfo-SMCC交联剂；也可使用货号A39268（10 × 2 mg）
0.22 µm针头式滤器	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV针头式滤器，0.22 µm，PVDF材质，33 mm，经γ射线灭菌
10 ml注射器	Omnilab		一次性注射器 Injekt® Solo B.Braun
Sterican®穿刺针	B. Braun		Sterican® G 20 x 1 1/2""；0.90 x 40 mm；黄色
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
管路连接器	Omnilab		Kleinfeld微型管路连接器，用于硅胶管