来源：Ji, Y., 等. 一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法。J. Vis. Exp. (2022)。
该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。
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方法文章
用于细胞DNA损伤检测的彗星实验
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 准备彗星实验所需材料
- 显微镜载玻片的制备
- 取1% (w/v) 正常熔点琼脂糖[溶于双蒸水（ddH2O）中]，加入50 mL离心管，用微波炉加热以使琼脂糖在ddH2O中完全溶解。将溶液置于37 °C保存，以防止在涂片前发生凝固。若发生凝固，应弃去并重新配制。
- 将显微镜载玻片浸入盛有1% (w/v) 正常熔点琼脂糖的50 mL离心管中，进行预包被。
- 浸渍后迅速擦干载玻片背面。
注意：若未正确擦干载玻片背面，将在显微镜分析步骤中增加背景噪声。 - 使用永久性记号笔在磨砂区域的右下角标记已包被的载玻片（图1A），以标明载玻片的预包被面。
- 室温下静置过夜，使琼脂糖凝固并干燥。
- 将干燥后的载玻片用纸巾包裹，并存放于盒子中保存。
2. 样品制备
- 培养的细胞
注意：首先，在开始彗星实验之前，用损伤试剂处理细胞。然后执行以下步骤。- 如果细胞为贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化以从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中释放细胞，并在适当的细胞汇合度下进行。通过添加含血清的培养基来中和胰蛋白酶。<....
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结果
图1：彗星试验载玻片和高通量载片架（显微镜载玻片载体）的代表性图像。 （A）为正确识别方向，显微镜载玻片上预包被的一面可通过载玻片右下角的黑点进行辨认。（B）高通量载片架的图像显示了载玻片如何保持紧密的垂直排列，载体上的卡扣可固定其在电泳槽中的方向。每个载体最多可容纳25张载玻片。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22 x 22 mm 玻璃盖玻片 | 美国新罕布什尔州汉普顿，Fisher Scientific | 631-0124 | |
| 配备荧光显微镜<br/> 使用相机 | 蔡司，德国耶拿 | ||
| 高通量彗星试验系统 | Cleaver Scientific | COMPAC-50 | |
| 人角质形成细胞（HaCaTs） | 美国典型培养物保藏中心<br/> (ATCC)，美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | 已停止使用 | 可从其他供应商购买<br/> 公司<br/> ADDEXBIO TECHNOLOGIES<br/> 货号 T0020001 |
| 过氧化氢（H2O2）<br/> 30% 水溶液 | 美国新罕布什尔州汉普顿，Fisher Scientific公司 | BP2633-500 | |
| 图像与数据分析软件 | Perceptive Instrument<br/> 英格兰伯里圣埃德蒙兹<br/> 英国 | 125525 | 免费的图像分析软件是<br/> 可用，例如 ImageJ |
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen<br/> 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | P4864 | |
| Na₂EDTA（二钠）<br/> 乙二胺四乙酸 | Sigma Aldrich,<br/> 密苏里州圣路易斯市，MO<br/> 美国 | E5134 | |
| NaCl（氯化钠） | Sigma Aldrich，<br/> 密苏里州圣路易斯市，MO<br/> 美国 | S7653 | |
| Nanopure Infinity 超纯水<br/> 系统（Barnstead Nanopure） | Thermo Scientific<br/> 马萨诸塞州沃尔瑟姆，<br/> 美国 | D11901 | 超纯水（16 MΩ·cm）Ω cm⁻¹ |
| NaOH（氢氧化钠） | Sigma Aldrich，<br/> 美国密苏里州圣路易斯 | E5134 | |
| 正常熔点琼脂糖 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | 16520100 | 用于预包被载玻片 |
| 碘化丙啶<br/> （1.0 mg/mL，水溶液） | Sigma Aldrich，<br/> 密苏里州圣路易斯市<br/> 美国 | 12-541BP486410ML | |
| 单面磨砂载玻片<br/> 载玻片 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | 12-541B | |
| 载玻片盒 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | 03-448-2 | 避光，以保护细胞免受光照损伤<br/> 形成非特异性损伤<br/> （根据普遍接受的观点）<br/> 并防止荧光褪色<br/> 染料 |
| 载玻片冷却板 | Cleaver Scientific，<br/> 英格兰拉格比<br/> 英国 | CSL-CHILLPLATE | |
| 处理皿 | Cleaver Scientific<br/> 英格兰拉格比<br/> 英国 | STAINDISH4X | |
| Tris碱 | Sigma Aldrich，<br/> 密苏里州圣路易斯市，MO<br/> 美国 | 93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | BP151-500 | |
| 胰蛋白酶EDTA（0.5%） | Invitrogen<br/> Gibco<br/> 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 15400054 | |
| 垂直载玻片架 | Cleaver Scientific<br/> 英格兰拉格比<br/> 英国 | COMPAC-25 |
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