来源：Ji, Y., 等. 一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法。J. Vis. Exp. (2022)。
该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。
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方法文章
用于细胞DNA损伤检测的彗星实验
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 准备彗星实验所需材料
- 显微镜载玻片的制备
- 取1% (w/v) 正常熔点琼脂糖[溶于双蒸水（ddH2O）中]，加入50 mL离心管，用微波炉加热以使琼脂糖在ddH2O中完全溶解。将溶液置于37 °C保存，以防止在涂片前发生凝固。若发生凝固，应弃去并重新配制。
- 将显微镜载玻片浸入盛有1% (w/v) 正常熔点琼脂糖的50 mL离心管中，进行预包被。
- 浸渍后迅速擦干载玻片背面。
注意：若未正确擦干载玻片背面，将在显微镜分析步骤中增加背景噪声。 - 使用永久性记号笔在磨砂区域的右下角标记已包被的载玻片（图1A），以标明载玻片的预包被面。
- 室温下静置过夜，使琼脂糖凝固并干燥。
- 将干燥后的载玻片用纸巾包裹，并存放于盒子中保存。
2. 样品制备
- 培养的细胞
注意：首先，在开始彗星实验之前，用损伤试剂处理细胞。然后执行以下步骤。- 如果细胞为贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化以从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中释放细胞，并在适当的细胞汇合度下进行。通过添加含血清的培养基来中和胰蛋白酶。
- 将细胞转移至50 mL离心管中，离心（例如，HaCaT细胞在室温下以300 × g 离心5分钟），小心弃去上清液，并向细胞沉淀中加入1 mL PBS。
- 进行细胞计数。
- 将30,000个细胞转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以7,607 × g 离心5分钟。
- 小心弃去上清液，并将细胞沉淀置于冰上避光保存，待进行彗星实验。
注意：在进行彗星实验前，应定期检测细胞是否存在支原体污染，以避免产生人为的DNA损伤及改变DNA损伤应答，已有文献报道。根据所用细胞类型的不同，可按需调整离心条件。
- 修复实验用培养细胞的制备
- 在细胞培养瓶或培养皿中培养细胞。
- 在使用损伤试剂处理细胞前，先用1 mL PBS轻轻洗涤细胞两次（例如，BE-M17细胞在冰上用50 µM H2O2处理20分钟），以防止处理过程中发生修复。
- 用1 mL PBS轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的损伤试剂。
- 重新加入细胞培养基，将细胞置于加湿培养箱（37 °C，5% CO2）中，使其在不同时间段内进行修复（例如，0分钟、30分钟、2小时、6小时、24小时和30小时）。
- 在每个时间点，收集30,000个细胞至含10%二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养基中，并在-80 °C下保存。
- 在进行彗星实验前，将细胞在37 °C水浴中快速解冻，并在4 °C下以7,607 × g 离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存，待进行实验（即从第3步开始）。
3. 细胞裂解
注意：所有操作均需在冰上进行。
- 每块凝胶使用 12,000 个细胞或 2.5 µL 全血。
- 使用微波炉配制溶于 PBS 的 0.6% (w/v) 低熔点琼脂糖溶液，并将其置于 37 °C 水浴中以防止凝固。
- 使用永久性记号笔或铅笔在预先包被的载玻片磨砂端标记研究者姓名、日期和处理信息。
- 将冷却板放置在平坦的实验台上，并将两个冷冻冷却包插入金属表面下方的滑动抽屉中（如图 2所示）。
- 将载玻片放置在冷却板上，在加入含 0.6% (w/v) 低熔点琼脂糖的细胞前，预先冷却 1–2 分钟。
注意：若将载玻片在冷却板上放置超过 1–2 分钟，由于环境湿度可能导致载玻片表面产生冷凝水，这会使低熔点琼脂糖凝胶在载玻片上的稳定性降低。 - 通过涡旋振荡重悬沉淀（步骤 2.2.7），确保完全去除上清液。立即将含有细胞沉淀的样品管放回冰上。
注意：将含样品的离心管放入离心机时，应使管盖铰链朝外，以便沉淀聚集在管的这一侧。有时沉淀难以观察，且在去除上清液时容易将其移位。以这种方向进行离心可确保操作者明确细胞沉淀的位置。 - 用 200 µL 0.6% 低熔点琼脂糖（LMP 琼脂糖）重悬细胞沉淀，并通过上下吹打混匀，避免产生气泡。随后，迅速将 80 µL 含细胞的 LMP 琼脂糖转移至预冷的载玻片上，并立即盖上盖玻片。
- 让凝胶在冷却板上静置 1–2 分钟使其凝固。
- 同时，配制 500 mL 裂解缓冲液工作液（表 1），并将其倒入裂解槽中（图 3）。
- 凝胶凝固后，用拇指和食指轻轻夹住载玻片，迅速滑动移除盖玻片。
- 将含有样品的载玻片放入载玻片架中（载玻片上所有黑色“圆点”标记应朝向同一方向放置）（图 1B），然后将载玻片架放入裂解槽中（图 3）。
- 盖上裂解槽盖子，并在 4 °C 冰箱中过夜或室温放置 30 分钟，具体选择应根据操作者的时间安排而定。
4. 电泳
- 小心地将载玻片架从裂解皿中取出，注意不要扰动凝胶。
- 轻轻将载玻片架放入预先装有冰冻ddH₂O的洗涤皿中2O 并静置 30 分钟，确保载玻片完全被 ddH₂O 覆盖2O.
- 在电泳槽下方的滑动抽屉内放入一个冷冻冷却包，以维持缓冲液的最佳温度。
- 小心加入预冷的电泳工作液（冰浴）表1将载玻片架放入电泳槽中，并将电泳槽连接电源。放置载玻片时，应使其透明端（即含有细胞凝胶的一端，而非磨砂标记端）朝向阴极（红色电极）。
- 将载玻片置于电泳槽中静置20分钟，使DNA松弛并解旋。此步骤期间保持电源关闭。
- 如有需要，可插入新的冷冻冷却包以增强降温效果。
- 以1.19 V/cm的电压进行电泳，持续20分钟，或根据已优化的条件进行。
注意： 建议各实验室优化电泳运行条件和缓冲液体积。电泳过程中仅使用一个载玻片架不会影响电泳缓冲液的电阻，作者也未观察到载玻片数量变化时电压或电流出现显著变化。 - 关闭电源，小心地将载玻片架从电泳槽中取出，并在纸巾上沥干30秒。
- 将载玻片架放入含有中和缓冲液的培养皿中（表1。静置20分钟。
- 从中和皿中取出载玻片架，放入盛有冰冻ddH2O的洗涤皿中，静置20分钟。
- 将载玻片架从水中取出，根据操作者的安排，将载玻片置于37 °C培养箱中干燥1小时，或在室温下过夜干燥，也可不进行干燥处理。
注意： 如果步骤4.11中没有干燥，则执行5.2的染色步骤。
5. 碘化丙啶（PI）染色
- 将载玻片架转移至含有冰冻ddH2O的洗涤皿中，以重新水化载玻片，并静置30分钟。
- 将载玻片架放入含有2.5 µg/mL碘化丙啶溶液的染色皿中。
注意：碘化丙啶对光敏感，因此需在避光环境中操作。该物质也有毒性。 - 盖上染色皿盖子，在室温下避光孵育20分钟。
- 将载玻片架转移至另一个独立的皿中，用冰冻ddH2O洗涤20分钟。
- 从皿中取出载玻片架，在避光条件下完全干燥，可选择在37 °C培养箱中或室温下干燥，具体取决于操作者的安排或偏好。
- 载玻片完全干燥后，将其从载玻片架上取下，放入载玻片盒中避光保存，直至进行图像分析。
注意：载玻片可长期保持可读性，必要时可重新染色。
6. 彗星评分与数据分析
注意：“彗星”一词源于实验完成后在显微镜下观察受损细胞时所呈现的图像（图4）。在电泳条件下，未受损细胞中的DNA基本不发生迁移，而是保留在一个球形结构中，称为彗星“头部”。然而，若存在DNA链断裂，细胞的DNA便会从头部迁移出来，形成一条“尾部”，从而呈现出类似彗星的形态（图4）。尾部中包含的DNA越多，表明DNA损伤越严重。
- 打开荧光显微镜的PI（红色）滤光片（λ = 536/617 nm），并启动彗星图像分析软件。
- 使用巴斯德移液管向凝胶滴加一滴水，并盖上盖玻片。
- 将载玻片放入荧光显微镜中，对彗星进行“评分”。
注意： 评分是一种评估彗星状图像的方法，用于确定每个彗星中所存在的损伤程度。通常可根据使用者的偏好采用两种方法之一进行：目视评分（根据0到4的等级对彗星大小进行判断）或使用免费或商业软件30。一般而言，这两种方法均以彗星尾部的大小作为评估指标，但也可测定多种与彗星相关的终点参数。若使用软件，请点击彗星头部的中心位置，等待软件自动识别彗星，随后将对所选终点参数进行分析图4). - 每块凝胶分析50个彗星，每个样本分析100个彗星（即每个样本对应不同的DNA损伤处理或其重复）。
- 重复实验两次（n = 2）或三次（n = 3）。
注意： 如果仅进行 n=2 次重复实验，则无法进行统计分析；若 n=3，应进行 D'Agostino 正态性检验。大多数彗星实验数据无法通过正态性检验。在此情况下，应采用非参数检验（Kruskal-Wallis 检验结合 Dunn 多重比较检验，以及 Mann-Whitney 检验，显著性水平设定为 p < 0.05).
| 试剂 | 储存液 | 工作液 |
| 裂解缓冲液 | 100 mM Na2EDTA、2.5 M NaCl 和 10 mM Tris 碱溶于 ddH2O；用 10 M NaOH 调节 pH 至 10 | 裂解储存液中含 1% Triton X-100 |
| 电泳缓冲液 | 10 M NaOH 和 200 mM Na2EDTA 溶于 ddH2O | 300 mM NaOH 和 1 mM Na2EDTA；pH > 13 |
| 中和缓冲液 | 0.4 M Tris 碱溶于 ddH2O；用 HCl 调节 pH 至 7.5 | |
| 染色缓冲液 | 1 mg/mL 碘化丙啶 | 2.5 µg/mL 碘化丙啶溶于 ddH2O |
表1：高通量碱性彗星试验（HTP ACA）中所用试剂的组成。 显示了裂解液、电泳液、中和液和染色缓冲液的储存浓度和工作浓度。
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结果
图1：彗星试验载玻片和高通量载片架（显微镜载玻片载体）的代表性图像。 （A）为正确识别方向，显微镜载玻片上预包被的一面可通过载玻片右下角的黑点进行辨认。（B）高通量载片架的图像显示了载玻片如何保持紧密的垂直排列，载体上的卡扣可固定其在电泳槽中的方向。每个载体最多可容纳25张载玻片。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22 x 22 mm 玻璃盖玻片 | 美国新罕布什尔州汉普顿，Fisher Scientific | 631-0124 | |
| 配备荧光显微镜<br/> 使用相机 | 蔡司，德国耶拿 | ||
| 高通量彗星试验系统 | Cleaver Scientific | COMPAC-50 | |
| 人角质形成细胞（HaCaTs） | 美国典型培养物保藏中心<br/> (ATCC)，美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | 已停止使用 | 可从其他供应商购买<br/> 公司<br/> ADDEXBIO TECHNOLOGIES<br/> 货号 T0020001 |
| 过氧化氢（H2O2）<br/> 30% 水溶液 | 美国新罕布什尔州汉普顿，Fisher Scientific公司 | BP2633-500 | |
| 图像与数据分析软件 | Perceptive Instrument<br/> 英格兰伯里圣埃德蒙兹<br/> 英国 | 125525 | 免费的图像分析软件是<br/> 可用，例如 ImageJ |
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen<br/> 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | P4864 | |
| Na₂EDTA（二钠）<br/> 乙二胺四乙酸 | Sigma Aldrich,<br/> 密苏里州圣路易斯市，MO<br/> 美国 | E5134 | |
| NaCl（氯化钠） | Sigma Aldrich，<br/> 密苏里州圣路易斯市，MO<br/> 美国 | S7653 | |
| Nanopure Infinity 超纯水<br/> 系统（Barnstead Nanopure） | Thermo Scientific<br/> 马萨诸塞州沃尔瑟姆，<br/> 美国 | D11901 | 超纯水（16 MΩ·cm）Ω cm⁻¹ |
| NaOH（氢氧化钠） | Sigma Aldrich，<br/> 美国密苏里州圣路易斯 | E5134 | |
| 正常熔点琼脂糖 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | 16520100 | 用于预包被载玻片 |
| 碘化丙啶<br/> （1.0 mg/mL，水溶液） | Sigma Aldrich，<br/> 密苏里州圣路易斯市<br/> 美国 | 12-541BP486410ML | |
| 单面磨砂载玻片<br/> 载玻片 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | 12-541B | |
| 载玻片盒 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | 03-448-2 | 避光，以保护细胞免受光照损伤<br/> 形成非特异性损伤<br/> （根据普遍接受的观点）<br/> 并防止荧光褪色<br/> 染料 |
| 载玻片冷却板 | Cleaver Scientific，<br/> 英格兰拉格比<br/> 英国 | CSL-CHILLPLATE | |
| 处理皿 | Cleaver Scientific<br/> 英格兰拉格比<br/> 英国 | STAINDISH4X | |
| Tris碱 | Sigma Aldrich，<br/> 密苏里州圣路易斯市，MO<br/> 美国 | 93362 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific<br/> 美国新罕布什尔州汉普顿 | BP151-500 | |
| 胰蛋白酶EDTA（0.5%） | Invitrogen<br/> Gibco<br/> 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 15400054 | |
| 垂直载玻片架 | Cleaver Scientific<br/> 英格兰拉格比<br/> 英国 | COMPAC-25 |
