用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

摘要

来源：Ji, Y., 等. 一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法。J. Vis. Exp. (2022)。

该视频演示了在暴露于有害物质后，利用彗星实验检测DNA损伤的方法。在碱性条件下，DNA解旋并发生变性，经过电泳后，未受损和受损的DNA在琼脂糖凝胶中的迁移行为不同，形成彗星状结构。迁移较慢的未受损DNA构成圆形的彗星头部，而迁移较快的受损DNA片段则形成拉长的彗星尾部。

方案

1. 准备彗星实验所需材料

1. 显微镜载玻片的制备
   1. 取1% (w/v) 正常熔点琼脂糖[溶于双蒸水（ddH₂O）中]，加入50 mL离心管，用微波炉加热以使琼脂糖在ddH₂O中完全溶解。将溶液置于37 °C保存，以防止在涂片前发生凝固。若发生凝固，应弃去并重新配制。
   2. 将显微镜载玻片浸入盛有1% (w/v) 正常熔点琼脂糖的50 mL离心管中，进行预包被。
   3. 浸渍后迅速擦干载玻片背面。
      注意：若未正确擦干载玻片背面，将在显微镜分析步骤中增加背景噪声。
   4. 使用永久性记号笔在磨砂区域的右下角标记已包被的载玻片（图1A），以标明载玻片的预包被面。
   5. 室温下静置过夜，使琼脂糖凝固并干燥。
   6. 将干燥后的载玻片用纸巾包裹，并存放于盒子中保存。

2. 样品制备

1. 培养的细胞
   注意：首先，在开始彗星实验之前，用损伤试剂处理细胞。然后执行以下步骤。
   1. 如果细胞为贴壁细胞，使用胰蛋白酶消化以从细胞培养瓶或细胞培养培养皿中释放细胞，并在适当的细胞汇合度下进行。通过添加含血清的培养基来中和胰蛋白酶。<....

结果

图1：彗星试验载玻片和高通量载片架（显微镜载玻片载体）的代表性图像。 （A）为正确识别方向，显微镜载玻片上预包被的一面可通过载玻片右下角的黑点进行辨认。（B）高通量载片架的图像显示了载玻片如何保持紧密的垂直排列，载体上的卡扣可固定其在电泳槽中的方向。每个载体最多可容纳25张载玻片。

材料