放射性标记氨基酸摄取检测法用于定量细胞对氨基酸的摄取

摘要

来源：Shen, L., 等 培养骨细胞与分离骨骨干中氨基酸消耗的评估。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了一种用于体外评估骨髓来源基质细胞摄取氨基酸的技术。钠离子（Na⁺）依赖性氨基酸转运蛋白介导放射性标记氨基酸进入细胞，通过测量放射活性来估算细胞对氨基酸的摄取量。

方案

使用放射性物质（RAM）需事先获得各机构指定安全委员会的批准。

1. 细胞中氨基酸的摄取

1. 在12孔组织培养板的每孔中接种5 × 10⁴个ST2细胞。使用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和0.1 µg/mL链霉素（Pen/Strep）的α-MEM培养基进行接种。额外接种若干孔细胞，用于在步骤1.12中对各实验条件下的细胞数量进行定量归一化。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润化细胞培养箱中孵育。
2. 培养细胞2–3天，直至形成汇合单层。
3. 实验当天，配制以下溶液：1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4；以及Krebs Ringers HEPES（KRH）缓冲液，pH 8.0（120 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、NaHCO₃、5 mM HEPES、1 mM D-葡萄糖）。将溶液预热至37 °C。
4. 吸除培养基，用1 mL 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
   注意：本方案也适用于快速增殖的非汇合细胞。在此情况下，需将放射性活度归一化至绝对细胞数量或DNA含量。此外，可考虑增大培养板或培养瓶的规格，以提高总体细胞数量和每分钟计数（cpm）值。此参数需根据具体情况通过实验经验确定。
5. 吸除1× PBS，用1 mL KRH缓冲液洗涤细胞一次。
6. 通过将4 µL [1 µCi µL^-1] L-[3,4-³H]-谷氨酰胺储备液加入1 mL KRH缓冲液中，配制成终浓度为4 µCi/mL的L-[3,4-³H]-谷氨酰胺工作液。
   注意：在使用放射性物质前，请联系所在机构的辐射安全办公室以获取使用许可。所有涉及辐射的操作必须在有机玻璃屏蔽板后进行。
7. 用0.5 mL含4 µCi/mL L-[3,4-³H]-谷氨酰胺工作液的KRH缓冲液孵育细胞5分钟。
8. 收集放射性培养基并转移至液体放射性废物容器中。用冰冻KRH缓冲液快速洗涤细胞3次以终止反应。将所有洗涤液均收集并弃入液体放射性废物容器中。
9. 向每孔加入1 mL 1% SDS溶液，吹打10次以裂解并匀浆细胞。将细胞裂解液转移至1.5 mL离心管中。将细胞培养板、移液管及枪头弃入固体放射性废物容器中。
10. 在>10,000 × g条件下离心10分钟。将上清液转移至含8 mL闪烁液的闪烁瓶中。剧烈振荡闪烁瓶以混匀。将离心管和枪头弃入固体放射性废物容器中。
11. 使用液体闪烁计数器测定每分钟计数（cpm）。将闪烁瓶弃入闪烁瓶专用废物容器中。
12. 对剩余非放射性培养板中的细胞进行胰酶消化、重悬并计数（参见步骤1.1），以估算被裂解的放射性培养物中的细胞数量。使用血细胞计数板对每种实验条件下各非放射性孔的细胞数量进行计数。将步骤1.11中获得的cpm值归一化至非放射性培养板中估算的细胞数量。
13. 实验结束后，使用放射性去污喷雾对细胞培养超净台、实验台面及所有仪器进行去污染处理。最后进行擦拭测试，确保工作区域无放射性残留。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	25200
12 孔板	Corning	3513
Beckman LS6500 液体闪烁计数器
氯化钙	Sigma	C1016
氯化胆碱	Sigma	C7077
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
DPBS	Gibco	14190
HEPES(1M)	Gibco	15630
L-[3,4-3H(N)]-谷氨酰胺	PerkinElmer	NET551250UC
液体闪烁计数小瓶	Sigma	Z190535
8M 氯化锂溶液	Sigma	L7026
氯化镁	Sigma	M8266
MEMα	Gibco	12561
微量离心管，15 mL	Biotix	89511-256
氯化钾	Sigma	P3911
碳酸氢钠	Sigma	S6014
氯化钠	Sigma	S9888
十二烷基硫酸钠	Sigma	436143
Ultima Gold（闪烁液）	PerkinElmer	6013329
α-(甲氨基)异丁酸	Sigma	M2383