测试样品中乳酸含量的比色测定法

摘要

来源：Yanase, S.，等。线虫秀丽隐杆线虫中细胞内乳酸和丙酮酸的小规模比色测定法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种利用乳酸脱氢酶酶对细胞裂解液中乳酸进行比色测定的方法。该酶可将乳酸转化为丙酮酸，同时将NAD转化为NADH，后者与四氮唑染料反应生成有色产物，可通过分光光度法测定以定量乳酸含量。

方案

1. C. elegans 的同步培养

1. 接种前，将大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）OP50 菌株在 37 °C 下于 300 mL LB 液体培养基中过夜培养。培养后的 OP50 保存于 -4 °C。
   1. 配制 LB 液体培养基时，称取 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl 和 1.5 mL 1 N NaOH，加入去离子水至 1 L，高压灭菌。
      注意：OP50 及 C. elegans 菌株可从秀丽隐杆线虫遗传中心（美国明尼苏达州圣保罗市，明尼苏达大学）获取。
2. 配制线虫生长培养基（NGM）琼脂：称取 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨、17 g 琼脂，加入 975 mL 去离子水，高压灭菌。冷却至 55 °C 后，在无菌条件下依次加入 1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、1 mL 5 mg/mL 胆固醇乙醇溶液，以及 25 mL 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 6.0），混匀后倒入 90 mm 培养皿中。
   1. 配制 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）：称取 108.3 g KH₂PO₄ 和 46.6 g K₂HPO₄，加去离子水至 1 L，高压灭菌。
3. 将 1–2 mL 培养好的 OP50 均匀涂布于 NGM 琼脂平板上。为形成较薄的菌层，需在接种线虫前将平板于室温孵育过夜。
   注意：接种了 OP50 的 NGM 琼脂平板可在室温下保存 2–3 周。
4. 将至少 100 条线虫接种至含 OP50 的 NGM 琼脂平板上，于 20 °C 培养至成虫阶段。至少需要准备三块平板。
5. 为收集体内卵，将来自三块 NGM 琼脂平板的产卵期雌雄同体线虫分别转移至含有 5 mL S 缓冲液的 15 mL 圆锥管中，用 15 mL S 缓冲液洗涤线虫 3 次，每次在室温下以 300 x g 离心 30 秒。
   1. 配制 S 缓冲液：称取 5.9 g NaCl 和 50 mL 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 6.0），加去离子水至 1 L，高压灭菌。
6. 将线虫置于碱性次氯酸盐溶液中进行无菌化处理并大量分离卵（0.5 mL 新鲜漂白液或等效物：含 5–6% 次氯酸钠，0.1 mL 10 M NaOH，约 4.5 mL S 缓冲液），室温下颠倒混匀，静置 10–15 分钟。
   注意：15 分钟内，成虫应完全溶解，留下浑浊的游离卵悬液（可用体视显微镜确认卵的释放情况）。也可使用 0.2 mL 5 N NaOH 代替 0.1 mL 10 N NaOH。
7. 次氯酸盐处理后，用 15 mL S 缓冲液洗涤卵沉淀物 3 次，最后重悬于 5–6 mL S 缓冲液中。将释放出的卵在不含 E. coli 的 S 缓冲液中于 20 °C 过夜培养，以获得年龄同步化的 L1 期幼虫。
8. 为估算 L1 期幼虫的大致数量，将幼虫充分重悬至少 3 次后，取 10 µL S 缓冲液样品在体视显微镜下计数，计算平均值。随后将 L1 期幼虫转移至五块含 OP50 的 NGM 琼脂平板上（每块 90 mm 培养皿接种 1,500–3,000 条线虫），于 20 °C 培养至年轻成虫阶段（即自体受精开始并产下少量卵时，通常为 3 天后）。

2. 从 C. elegans 提取细胞组分

1. 从五个 NGM 琼脂平板中用 S 缓冲液收集年轻成虫阶段（5 日龄）的线虫（图 1A）。
   1. 使用蔗糖法 6 通过 30% (w/v) 蔗糖漂浮选择仅存活的线虫：将悬浮于 3–4 mL S 缓冲液中的线虫与等体积的冰冻 60% (w/v) 蔗糖混合于 15 mL 锥形管中。在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 15 秒，用巴斯德移液管将漂浮的线虫从管壁转移至新管中。
2. 用 S 缓冲液洗涤线虫 3 次，每次在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 30 秒。离心后使用 1,000 µL 微量移液器吸头检查洗涤后线虫的湿体积（图 1B）。
3. 向洗涤后的线虫中加入等体积的冰冻 10% (w/v) 三氯乙酸（TCA；终浓度为 5%），用于蛋白质沉淀（图 1C）。可使用高氯酸（PCA）或偏磷酸代替 TCA。
4. 在冰上使用聚四氟乙烯匀浆器（Potter-Elvehjem 组织研磨器），以最高 1,300 rpm 的转速旋转，用研杵匀浆 40 次，使线虫与沉淀剂充分混合。
5. 用巴斯德移液管将匀浆液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，在冰上使用超声波匀浆器进行超声处理 3 分钟（每次 1 分钟，共 3 次），占空比为 20%。
6. 在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟，澄清匀浆液。将上清液在冰上用 4 M KOH（每 10% TCA 体积加入 0.25 倍体积）中和 20 分钟，然后在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。上清液（作为测试样品）可储存于 -80 °C，直至后续检测。

3. 使用比色法检测试剂盒检测乳酸

1. 使用比色法检测试剂盒（材料表）测定待测样品中乳酸的浓度。对待测样品进行双孔检测。取5或10 µL待测样品加入96孔板中，并用试剂盒提供的乳酸检测缓冲液将每孔体积调整至50 µL。
2. 对于乳酸标准曲线，用乳酸检测缓冲液将100 mM L(+)-乳酸标准品稀释至1 mM。分别取0、2、4、6、8和10 µL的1 mM L(+)-乳酸标准品（试剂盒提供）加入一系列孔中。
3. 向每个孔中加入50 µL反应混合液（包含46:2:2比例的乳酸检测缓冲液、乳酸酶混合液和DMSO无水溶液中的乳酸探针；所有试剂均由试剂盒提供）或背景对照混合液（包含48:2比例的乳酸检测缓冲液和乳酸探针），在避光条件下于室温孵育30–60分钟。
4. 使用酶标仪在570 nm处测定各孔的吸光度，并从反应混合液的吸光度中减去背景对照混合液的吸光度。
5. 绘制乳酸标准曲线。根据乳酸标准曲线计算待测样品的乳酸浓度。

结果

图 1. 细胞代谢物提取流程。 （A）将 1,500–3,000 条线虫置于 NGM 琼脂平板（90 mm 培养皿）上。来自五个平板的线虫提取物足以用于比色法检测。（B）图中左侧和右侧分别显示从每个平板上收集 3,000 条和 1,500 条线虫的情况。每个 15 mL 离心管中的湿体积均< 0.5 mL，此量已足够检测。（C）在匀浆过程中使用 10% 三氯乙酸（TCA）进行蛋白质沉淀。必须先将线虫加入装有预冷 10% TCA 的匀浆器中，再进行匀浆处理。否则，使用比色法检测试剂盒将无法检测到样品中的细胞乳酸...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乳酸比色/荧光检测试剂盒	BioVision	#K607-100	比色/荧光<br/> 100次检测；储存于-20°C
三氯乙酸	和光纯药工业	#207-04955	室温保存
聚四氟乙烯匀浆器	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	可使用Wheaton公司生产的Iwaki/Pyrex替代品