用于测定蠕虫细胞组分中丙酮酸水平的丙酮酸检测试验

摘要

来源：Yanase, S. 等. 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）细胞内乳酸和丙酮酸的小规模比色测定法. 视觉化实验杂志 (2018).

本视频介绍了一种比色法检测技术，用于定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）细胞组分中的丙酮酸含量。该方法利用丙酮酸氧化酶与细胞内丙酮酸发生酶促反应所产生的过氧化氢，使一种生色染料被氧化生成有色产物，通过比色法测定该产物以确定丙酮酸的浓度。

方案

1. C. elegans 的同步培养

1. 接种前，将大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）菌株OP50在37 °C下于300 mL LB液体培养基中过夜培养。培养后的OP50保存于-4 °C。
   1. 配制LB液体培养基时，称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl和1.5 mL 1 N NaOH，加入去离子水定容至1 L，高压灭菌。
      注意：OP50及C. elegans菌株可从秀丽隐杆线虫遗传中心（美国明尼苏达州圣保罗市，明尼苏达大学）获取。
2. 配制线虫生长培养基（NGM）琼脂：称取3 g NaCl、2.5 g蛋白胨、17 g琼脂，加入975 mL去离子水，高压灭菌。冷却至55 °C后，在无菌条件下依次加入1 mL 1 M MgSO₄、1 mL 1 M CaCl₂、1 mL 5 mg/mL胆固醇乙醇溶液，以及25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0），倒入90 mm培养皿中。
   1. 配制1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0）：称取108.3 g KH₂PO₄和46.6 g K₂HPO₄，加去离子水定容至1 L，高压灭菌。
3. 将1–2 mL培养好的OP50菌液涂布于NGM琼脂平板上。为形成较薄的菌层，需在接种线虫前将平板于室温孵育过夜。
   注意：接种了OP50的NGM琼脂平板可在室温下保存2–3周。
4. 将至少100条线虫转移至含OP50的NGM琼脂平板上，于20 °C培养至成虫阶段。至少需要准备三块平板。
5. 为收集体内卵，将来自三块NGM琼脂平板的抱卵雌雄同体线虫分别转移至含有5 mL S缓冲液的15 mL锥形管中，用15 mL S缓冲液洗涤线虫3次，每次在室温下以300 x g离心30秒。
   1. 配制S缓冲液：称取5.9 g NaCl和50 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0），加去离子水定容至1 L，高压灭菌。
6. 将线虫置于碱性次氯酸盐溶液中以实现无菌化并大量分离卵（0.5 mL新鲜漂白剂或等效物：5–6%次氯酸钠、0.1 mL 10 M NaOH、约4.5 mL S缓冲液），室温下颠倒混匀，静置10–15分钟。
   注意：15分钟内，成虫应完全溶解，留下浑浊的游离卵悬液（应使用体视显微镜确认游离卵的存在）。也可使用0.2 mL 5 N NaOH替代0.1 mL 10 N NaOH。
7. 次氯酸盐处理后，用15 mL S缓冲液洗涤卵沉淀物3次，再重悬于5–6 mL S缓冲液中。将释放出的卵在不含E. coli的S缓冲液中于20 °C过夜孵育，以获得年龄同步化的L1期幼虫。
8. 为估算L1期幼虫的大致数量，将幼虫重悬至少3次后，取10 µL S缓冲液在体视显微镜下计数，计算平均值。随后将L1期幼虫转移至五块含OP50的NGM琼脂平板上（每块90 mm培养皿接种1,500–3,000条幼虫），于20 °C培养至年轻成虫阶段（即自体受精开始并产下少量卵时，通常为3天后）。

2. 从秀丽隐杆线虫（C. elegans）中提取细胞组分

1. 用 S 缓冲液从五个 NGM 琼脂平板上收集成年早期阶段（5 日龄）的线虫（图 1A）。
   1. 使用蔗糖法 6 通过 30% (w/v) 蔗糖漂浮法选择仅存活的线虫：将悬浮于 3–4 mL S 缓冲液中的线虫与等体积的冰冻 60% (w/v) 蔗糖混合于 15 mL 圆锥形离心管中。在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 15 秒，用巴斯德移液管将漂浮的线虫从管壁转移至新管中。
2. 用 S 缓冲液洗涤线虫 3 次，每次在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 30 秒。离心后使用 1,000 µL 微量移液器吸头检查洗涤后线虫的湿体积（图 1B）。
3. 向洗涤后的线虫中加入等体积的冰冻 10% (w/v) 三氯乙酸（TCA；终浓度为 5%），用于蛋白质沉淀（图 1C）。除 TCA 外，也可使用高氯酸（PCA）或偏磷酸。
4. 在冰上使用聚四氟乙烯匀浆器（Potter-Elvehjem 组织研磨器），以最高 1,300 rpm 的转速旋转，用研杵进行 40 次研磨，将线虫与沉淀剂匀浆。
5. 用巴斯德移液管将匀浆液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，在冰上使用超声波匀浆器进行 3 分钟超声处理（每次 1 分钟，共 3 次），占空比为 20%。
6. 在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟澄清匀浆液。在冰上用 4 M KOH（每 10% TCA 体积加入 0.25 倍体积）中和上清液 20 分钟，然后在 4 °C 下以 8,000 × g 离心 10 分钟。上清液（作为测试样品）可储存于 -80 °C，用于后续检测。

3. 使用比色法检测试剂盒检测丙酮酸

1. 使用比色法检测试剂盒（材料表）测定上清液（待测样品）中丙酮酸的浓度。对待测样品进行双孔重复检测。取10 µL待测样品与90 µL工作试剂（按94:1比例混合试剂盒提供的酶混合液与染料试剂）加入96孔板中，于室温避光孵育30分钟。
2. 使用酶标仪在570 nm波长下测定各孔的吸光度。
3. 绘制丙酮酸标准曲线。根据丙酮酸标准曲线计算待测样品中丙酮酸的浓度。

结果

图1. 细胞代谢物提取流程。 (A) 将1,500至3,000条线虫置于NGM琼脂平板（90 mm培养皿）上。从五个平板中提取的样品足以用于比色法检测。(B) 分别在图中左侧和右侧显示了从每个平板含有3,000条和1,500条线虫的五个平板中收集的线虫。每个15 mL离心管中的湿体积均< 0.5 mL，此量已足够检测使用。(C) 在线虫匀浆过程中使用10%三氯乙酸（TCA）进行蛋白质沉淀。必须先将线虫加入装有预冷的10% TCA的匀浆器中，再进行匀浆处理。否则，使用比色法检测试剂盒将无法检测到样品中的细胞乳酸和丙酮酸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EnzyChrom 丙酮酸检测试剂盒	BioAssay Systems	#EPYR-100	比色法/荧光法，100次检测；储存于-20°C
三氯乙酸	Wako Pure Chemical	#207-04955	室温储存
聚四氟乙烯匀浆器 	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	可使用Wheaton产品替代Iwaki/Pyrex