分光光度法测定糖原合酶活性

摘要

来源：  Wilson W.A.，研究真核生物糖原代谢的分光光度法。 J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了一种用于测定糖原合酶活性的分光光度法实验。该方法基于NADH随时间推移其吸光度降低的原理，从而反映糖原合酶的活性。

方案

1. 糖原合酶活性的测定

1. 按照表1所示，在实验前一天配制所需试剂的储备液。
2. 在实验当天，将4.5 mg NADH溶解于1.5 mL 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，配制4 mM NADH工作液。置于冰上保存，并避光。
3. 将UDP-葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和NDP激酶的储备液在冰上解冻。
4. 将水浴预热至30 °C。
5. 在1.5 mL离心管中，加入表2所列的反应混合试剂，设置每组糖原合酶反应体系。
   注意：为便于操作，可配制预混液（master mix），其中包含上述每种试剂的足量，以满足计划进行的所有反应体系的需要。
6. 准备一个空白对照反应，将上述混合液中的NADH替换为等体积水。转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中，并用于在分光光度计上于340 nm处调零。
7. 取770 µL上述反应混合液至1.5 mL离心管中，加入2 µL NDP激酶和2 µL丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合液，轻轻混匀，于30 °C孵育3分钟，以预热反应体系。
8. 加入30 µL溶于20 mM Tris缓冲液（pH 7.8）中的糖原合酶样品；混匀后，将反应液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。
9. 将比色皿放入分光光度计中，以定时间隔记录340 nm处的吸光度，持续10至20分钟。以时间为横坐标，绘制吸光度变化曲线。
   注意：应设置一个对照反应，其中糖原合酶样品被等体积20 mM Tris缓冲液替代，以排除NADH非酶促氧化的影响。根据样品纯度，可能还需设置其他对照反应。
10. 确定反应速率。

表1：测定糖原合酶活性所需的储备溶液。

组分	操作步骤
50 mM Tris pH 8.0	将0.61 g Tris碱溶解于约80 mL水中。冷却至4 °C，用HCl调节pH至8.0，再加水定容至100 mL。
20 mM HEPES缓冲液	将0.477 g HEPES溶解于约80 mL水中，用NaOH调节pH至7.0，再加水定容至100 mL。
132 mM Tris/32 mM KCl缓冲液 pH 7.8	将1.94 g Tris碱和0.239 g KCl溶解于约90 mL水中，用HCl调节pH至7.8，再加水定容至100 mL。
0.8% w/v 牡蛎糖原	称取80 mg牡蛎糖原，加入水中，加水定容至10 mL，轻轻加热并混匀，使糖原完全溶解。
100 mM UDP-葡萄糖	将0.31 g UDP-葡萄糖溶于水中，定容至1 mL。分装后于-20 °C冷冻保存，可稳定数月。
50 mM ATP	将0.414 g ATP溶解于约13 mL水中，用NaOH调节pH至7.5，再加水定容至15 mL。分装后于-20 °C冷冻保存，可稳定数月。
100 mM 葡萄糖-6-磷酸 pH 7.8	将0.282 g葡萄糖-6-磷酸溶解于约7至8 mL水中，用NaOH调节pH至7.8，再加水定容至10 mL。分装后于-20 °C冷冻保存，至少可稳定六个月。
40 mM 磷酸烯醇式丙酮酸	将4 mg磷酸烯醇式丙酮酸溶解于0.5 mL 20 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）中。于-20 °C保存，至少可稳定一周。
0.5 M MnCl2	将9.90 g MnCl2溶于水中，定容至100 mL。
NDP激酶	用适量水溶解冻干粉，配制成1 U/µL的溶液。分装后用液氮速冻，于-80 °C保存，至少可稳定一年。

表2：糖原合酶活性测定反应混合物的组成。

组分	体积 (µl)
160 mM Tris/32 mM KCl 缓冲液，pH 7.8	250
水	179
100 mM 葡萄糖-6-磷酸，pH 7.8	58
0.8 % w/v 牡蛎糖原	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-葡萄糖	28
40 mM 磷酸烯醇式丙酮酸	20
0.5 M MnCl2	8
终体积	770

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
来自糯玉米的支链淀粉（无直链淀粉）	Fisher Scientific	A0456
直链淀粉	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP，二钠盐	MilliporeSigma	A3377
D-葡萄糖-1,6-二磷酸，钾盐	MilliporeSigma	G6893
D-葡萄糖-6-磷酸，钠盐	MilliporeSigma	G7879
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，I型，来自酵母	MilliporeSigma	10127655001
糖原，II型，来自牡蛎	MilliporeSigma	G8751
己糖激酶	MilliporeSigma	11426362001
甲基丙烯酸酯比色皿，1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	必须使用甲基丙烯酸酯材质，因为某些步骤在340 nm或更低波长下进行
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐	MilliporeSigma	N0505
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型二钠盐	MilliporeSigma	43420
核苷5'-二磷酸激酶	MilliporeSigma	N0379
磷酸烯醇式丙酮酸，单钾盐	MilliporeSigma	P7127
来自兔肌肉的磷酸葡萄糖变位酶	MilliporeSigma	P3397
来自兔肌肉的磷酸化酶A	MilliporeSigma	P1261
来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶混合物	MilliporeSigma	P0294
UDP-葡萄糖，二钠盐	MilliporeSigma	U4625