基于阻抗的细胞检测法测定流感病毒感染复数

摘要

来源：Labadie, T.，等，利用实时细胞分析监测流感病毒在宿主外的存活情况。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们讨论了CIT₅₀与病毒感染复数之间的相关性。病毒感染的细胞表现出细胞病变效应，导致细胞死亡并从金微电极上脱落，从而降低阻抗。

方案

1. CIT₅₀ 值与感染复数之间的相关性

1. 在 E-板的每个孔中加入 100 µL 无菌 1x MEM 培养基。将 E-板插入仪器 35°C 的托架插槽中。
2. 按以下方法测量背景值：
3. 打开软件。
   1. 在 “默认实验模式设置” 中，选择相应的托架并双击顶部页面，输入实验名称。点击 “布局”，为板上每个选定孔输入必要的样品信息；完成后点击 “应用”。点击 “时间表” | “步骤” | “添加步骤”。软件将自动添加一个 1 秒的步骤，用于测量背景阻抗（CI）。
   2. 在 “执行” 选项卡中点击 “开始/继续”。点击 “绘图”，通过选择相应孔位将所有样品加入图表，并确保 CI 值在 -0.1 至 0.1 之间，然后进入下一步。
4. 从托架中取出 E-板。
5. 在电子微孔板的每个孔中接种 3 × 10⁴ 个新分裂的 MDCK 细胞，在 35°C、5% CO₂ 条件下培养 24 小时，使细胞在感染流感病毒（IAV）时处于增殖期。
6. 使用已知滴度为 6log₁₀TCID₅₀/mL 的 H1N1 病毒，按 10 倍系列稀释后，采用反向移液法接种 MDCK 细胞以确保可重复性，操作步骤如下：
   1. 用不含 FCS 的 100 µL MEM（病毒增殖培养基）清洗 MDCK 细胞 2 次。注意第二次清洗后应彻底去除所有培养基，以避免接种物进一步稀释。
   2. 使用单通道移液器在每个孔中加入 100 µL 病毒悬液。为避免污染，操作时应从左至右、再从上至下依次进行，并用盖子覆盖未操作的孔。
   3. 将板轻轻放入仪器 35°C 的托架插槽中。操作需轻柔，避免剧烈移动导致污染。
   4. 开始每 15 分钟监测一次细胞阻抗，持续至少 100 小时，具体操作如下：
      1. 将 E-板插入托架插槽。在软件中点击 “时间表” | “添加步骤”，设置每 30 分钟监测一次，共 200 次重复。然后选择 “开始/继续”。
   5. 完成两轮测量（即 30 分钟）后，在 “执行” 选项卡中点击 “暂停”，并将 E-板从托架中取出。
   6. 在病毒增殖培养基中加入 1 µg/mL TPCK-胰蛋白酶，以切割病毒血凝素。
   7. 向每个孔中加入 100 µL 含 TPCK-胰蛋白酶的病毒增殖培养基，并将 E-板插入托架插槽中。
   8. 在 “执行” 选项卡中点击 “开始/继续”。
      注意：务必设置阴性对照，即用病毒增殖培养基替代病毒悬液处理细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-板 16（6 块）	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-板有不同包装规格
MEM 1X	Life technologies (gibco)	31095029
TPCK-胰蛋白酶	Worthington	LS003740
xCELLigence 实时细胞分析仪 S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	xCELLigence RTCA S16 仪器有不同型号（16 孔、96 孔、单板或多板）