基于细胞阻抗的病毒存活动力学检测方法

摘要

来源：Labadie, T. 等，利用实时细胞分析监测流感病毒在宿主外的存活情况。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了一种基于细胞阻抗的技术，用于研究可诱导细胞病变效应的病毒的存活动力学。该方法通过测量经生理盐水预处理的病毒感染贴壁细胞的电学阻抗来实现。

方案

1. 试剂和起始材料的准备

1. MDCK 细胞和无菌细胞培养基的制备
   1. 在添加了 10% 热灭活胎牛血清（FCS）以及抗生素（100 单位/mL 青霉素，100 mg/mL 链霉素）的改良 Eagle 培养基（MEM）中培养 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞。
   2. 解冻后，感染前至少传代 2 次以确保细胞完全恢复（但传代次数少于 30 次，以避免细胞表型发生漂移）。
   3. 在含有 30 mL 无菌 1× MEM 的 75 cm²  组织培养瓶中接种 7.5 × 10⁶  个 MDCK 细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育。
2. 阻抗监测设备的准备
   1. 将仪器置于 35 °C 的培养箱中，预热至少 2 小时。
   2. 将其连接到放置在培养箱外的控制单元。
   3. 在开始后续实验前，按照制造商推荐的程序进行清洁。
3. 在 MDCK 细胞上制备流感病毒（IAV）毒株
   1. 为扩增 H1N1 病毒，在两个 75 cm² 组织培养瓶中各接种 7.5 × 10⁶ 个 MDCK 细胞，并在 37 °C 下孵育 24 小时，使其达到 90%–100% 汇合度。
   2. 从 75 cm² 培养瓶中的细胞单层中吸弃细胞培养基，用 5 mL 无菌 1× PBS 洗涤细胞。
   3. 吸除 PBS，再加入 5 mL 1× PBS 重复洗涤一次。
   4. 标记一个培养瓶作为对照组，吸除 PBS 后，小心地在单层细胞上加入 15 mL 病毒增殖培养基（含 0% FCS 的 1× MEM），并将该培养瓶置于 35 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育，用于 3 天增殖后的比较。
   5. 在室温下解冻一管 IAV 毒株，在含有病毒增殖培养基（含 0% FCS 的 1× MEM）的 1.5 mL 离心管中将病毒稀释至适当浓度。
   6. 从 75 cm² 培养瓶中吸除 1× PBS，通过向细胞单层加入 1 mL 稀释后的病毒液，以每细胞 1 × 10^-3 或 1 × 10^-4 斑块形成单位（pfu/细胞）的感染复数（MOI）感染 MDCK 细胞。
   7. 在室温下吸附病毒 45 分钟，每隔 15 分钟轻轻摇动培养瓶一次，使病毒与细胞充分结合。
   8. 轻柔吸除接种物，每瓶加入含 1 µg/mL TPCK-胰蛋白酶（trypsin/L-1-tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone）的 15 mL 病毒增殖培养基，以将病毒血凝素 HA0 切割为 HA1 和 HA2 亚基（此过程是 HA 与内涵体膜融合并释放病毒基因组所必需的）。
   9. 将培养瓶置于 35 °C、5% CO₂ 条件下孵育至少 3 天，以完成病毒复制。
   10. 在 40 倍显微镜下观察 MDCK 细胞，并与对照组培养瓶比较，观察细胞病变效应（CPE）。若 CPE 未完全（即约 80% 细胞从基质脱落），则将培养瓶继续放回培养箱孵育额外 24 小时。
   11. 当 CPE 完全时，吸弃细胞培养上清液，并在 300 × g 条件下离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。
   12. 将澄清的上清液转移至 15 mL 离心管中，分装子代病毒至一次性无菌冻存管中，立即置于 -80 °C 冻存。
4. 使用已知滴度为 6 log₁₀ TCID₅₀/mL 的 H1N1 病毒，按 10 倍系列稀释后感染 MDCK 细胞，为保证可重复性，请采用反向移液法并按以下步骤操作：
   1. 用不含 FCS 的 MEM（病毒增殖培养基）洗涤 MDCK 细胞 2 次，每次 100 µL。注意第二次洗涤后应彻底吸除所有培养基，以避免接种物被进一步稀释。
   2. 使用单通道移液器在每孔中加入 100 µL 病毒悬液。为避免污染，操作时应从左至右、从上至下依次进行，并用盖子覆盖未处理的孔。
   3. 将培养板轻柔放入 35 °C 仪器的托架槽中，避免剧烈移动导致污染。
   4. 按照步骤 2.10 所述，至少在 100 小时内每 15 分钟监测一次细胞阻抗。
   5. 完成两轮测量（即 30 分钟）后，点击"执行"选项卡中的"暂停"按钮暂停设备，然后将 E-板从托架中取出。
   6. 向病毒增殖培养基中加入 1 µg/mL TPCK-胰蛋白酶，以切割病毒血凝素。
   7. 向每孔加入含 TPCK-胰蛋白酶的病毒增殖培养基 100 µL，然后将 E-板重新插入托架槽中。8. 点击"开始/继续"按钮，在"执行"选项卡中启动监测。
      注意：务必设置阴性对照组，即用病毒增殖培养基替代病毒悬液，模拟感染细胞。

2. IAV 存活动力学

1. 将IAV暴露于35 °C的生理蒸馏水中，并通过测量细胞阻抗的降低随时间变化来检测其感染性。
   1. 通过将NaCl加入蒸馏水中，配制成终浓度为35 g/L的生理蒸馏水。向2 mL冻存管中加入900 µL生理水。
   2. 向生理水中加入100 µL病毒原液，将冻存管置于培养箱（35 °C，5% CO₂）中孵育1 h、24 h或48 h。
   3. 在16孔微孔板中每孔接种100 µL（含3 × 10⁴）新分裂的MDCK细胞，在37 °C和5% CO₂条件下培养24 h。
   4. 采用反向移液法，用已用培养基稀释10倍的暴露后病毒液100 µL感染细胞，重复步骤1.4以确保可重复性。
2. 至少持续100 h，每15 min监测一次细胞阻抗。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	ThermoFisher	25200056
75 cm² 组织培养瓶	Falcon	430641U
E-Plate 16（6 个板）	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-板有不同包装规格
FCS	Life technologies (gibco)	10270-106
MEM 1X	Life technologies (gibco)	31095029
PBS 1X	Life technologies (gibco)	14040091
青霉素-链霉素	Life technologies (gibco)	11548876
TPCK-胰蛋白酶	Worthington	LS003740
xCELLigence 实时细胞分析仪 S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	xCELLigence RTCA S16 仪器有不同规格（16 孔、96 孔、单板或多板）