硫代巴比妥酸反应物测定法评估人血清中的氧化应激

摘要

来源：Borges, C. R. 等., 使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激，J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了使用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）检测法评估生物样品中的氧化应激水平。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际有关人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. TBARS 测定

注意：一旦开始TBARS检测，应连续完成，不得中断。

1. 根据待分析样品的数量，取相应数量的样品和标准品，在 4 °C 条件下以 1500 × g 离心 10 分钟。离心后，将装有样品和标准品的玻璃管置于室温（RT）下。准备所需数量的玻璃管，并用样品名称进行标记。然后，向每根玻璃管中加入 100 μL 已制备的样品（HepG2 细胞裂解液、低密度脂蛋白、人血清）。
2. 向每个样品和标准品中加入 200 μL 的 8.1% SDS，轻轻旋转玻璃管使其充分混匀。
3. 向每个样品和标准品中加入 1.5 mL 的 3.5 M 醋酸钠缓冲液（pH = 4）。
4. 向每个样品和标准品中加入 1.5 mL 的 3.5 M 醋酸钠缓冲液（pH = 4）。
5. 通过加入 700 μL 去离子水，将每个样品和标准品的终体积调整至 4 mL。
6. 将每根玻璃管盖紧，置于设定为 95 °C 的加热块中孵育 1 小时。用铝箔覆盖玻璃管顶部，防止冷凝水形成。
7. 从加热块中取出玻璃管，置于冰上孵育 30 分钟。
8. 将样品和标准品在 4 °C 条件下以 1500 × g 离心 10 分钟。离心后，将装有样品和标准品的玻璃管置于室温（RT）下。
   注意：若将样品置于冰上或 4 °C 环境中，会导致整个样品或标准品发生沉淀。
9. 离心后立即从每根管中吸取 150 μL 上清液，转移至 96 孔板的独立孔中。
10. 使用移液器吸头去除每个孔中的气泡。
    注意：孔中存在气泡会导致吸光度读数不一致，从而引起检测结果精密度降低。
11. 在 532 nm 波长下读取吸光度值。从所有其他样品的吸光度值中减去空白样品的平均吸光度值。
12. 通过绘制 532 nm 处扣除空白后的吸光度值与各标准品已知浓度的关系图，建立标准曲线。使用线性回归拟合数据点。根据标准曲线所得线性回归方程计算未知样品的浓度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x 无菌 PBS，pH 7.4，1 L	VWR, PA	101642--262	细胞裂解试剂
50 mL 自立式离心管	Corning, NY	CLS430897	通用材料
96 孔板，未处理，透明，带盖，非无菌	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	用于测定吸光度
Amicon Ultra-0.5 100 kD 离心过滤装置	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL 纯化
玻璃管帽	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	用于 TBARS 测定
氯化铜 II	SIGMA, MO	222011-250G	用于诱导氧化
培养管，一次性，带螺旋盖，硼硅酸盐玻璃（13 x 100 mm）	VWR, PA	53283-800	用于 TBARS 测定
Eagle's 最低必需培养基 (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 细胞培养基
Eppendorf 安全锁扣管，1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	通用材料
Eppendorf 安全锁扣管，2.0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	通用材料
胎牛血清，美国来源	Omega Scientific, CA	FB-11	用于细胞培养
冰醋酸	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS 试剂
Halt 蛋白酶抑制剂混合物 (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	细胞裂解试剂
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL 溶剂
盐酸 (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	细胞裂解试剂
Legend Micro 17 离心机	Thermo Scientific, MA	75002431	通用材料
低密度脂蛋白，人血浆来源	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	生物基质原型
磁力搅拌子，八角形 6 件装组合	VWR, PA	58948-025	通用材料
丙二醛双(二甲基缩醛)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS 标准品
Multiskan Go 微孔板分光光度计	Fisher Scientific, NH	51119200	用于测定吸光度
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	细胞裂解试剂
氯化钠	SIGMA, MO	S7653-1KG	细胞裂解试剂
十二烷基硫酸钠 (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS 试剂
氢氧化钠	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS 试剂
SpeedVac 浓缩仪	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	用于浓缩细胞裂解液
硫代巴比妥酸	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS 试剂
TRIS 碱	Fluka, GA	93362	细胞裂解试剂