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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 准备
- 在500 mL含血清的完全经典培养基中加入5 mL青霉素/链霉素（10000 U/mL）以及5 mL和10 mL市售补充剂。先将培养基分装为每份50 mL。
注意：避免将任何培养基倒回原储备液中，以防污染。
- 将一份完全经典培养基置于冰上。
- 使用70%乙醇清洁解剖显微镜、镊子和剪刀。
- 准备两个细胞培养皿（10 cm），一个放置在解剖显微镜下，另一个置于冰上；每个培养皿中加入10 mL完全经典培养基。
2. 实验步骤（图1）
- 使用腹腔注射75-100 mg/kg的氯胺酮和7.5-10 mg/kg的赛拉嗪，在出生后（P）20天左右处死C57BL/6J小鼠。解剖前将眼球置于冰上含有完全经典培养基的容器中保存。
- 去除眼球周围的结缔组织（肌肉和脂肪组织）以及视神经。
- 使用显微剪刀在角膜缘后方约0.5 mm处做环形切割，移除角膜/虹膜复合体、玻璃体和晶状体。
- 从切口边缘向视神经方向做一条1 mm长的垂直切口，并切割出一条宽约1 mm的环形组织带。分离该复合体的中央区与周边区，用镊子将视网膜从RPE/脉络膜/巩膜复合体上剥离下来。
- 将周边部脉络膜组织带置于冰上含有完全经典培养基的容器中保存；分离另一只眼球并重复上述步骤，获得第二条组织带。
- 将环形组织带切成6个大小相近的方形小块（约1 mm × 1 mm）。
注意：切勿触碰任何边缘。
- 根据制造商说明解冻基底膜提取物（BME）。向24孔细胞培养板每孔中心加入30 μL BME，确保BME液滴在孔底形成凸起的穹顶状，且不接触孔壁。
注意：BME应在冰箱中过夜解冻。解冻后任何时候均需置于冰上。
- 将组织放置于BME的中央位置。
注意：不要压平脉络膜外植体；通常让组织在BME内自然展开。组织的方向（巩膜面朝上或朝下）不影响实验结果。
- 将培养板置于37 °C孵育10分钟，使凝胶固化。
- 每孔加入500 μL完全经典培养基。
- 每隔一天更换一次经典培养基（500 μL/孔）。3天后可在显微镜下观察到脉络膜出芽现象。
注意：如需进行生长因子处理，先让组织饥饿培养4小时。将待试化合物用低生长因子培养基稀释（增强比例为1:200，而非1:50）。
3. SWIFT-脉络膜计算机量化方法（图2）
注意：采用了一种计算机化方法来测量生长血管所覆盖的面积。在进行定量分析之前，需要准备一个适用于ImageJ软件的宏插件。
- 在 ImageJ 中打开脉络膜出芽图像，并通过灰度检查 “图像 | 类型 | 8 位”。
- 进入 “图像 | 调整 | 亮度/对比度 (Ctrl/Shift/C)”，优化对比度。
- 使用魔棒工具勾勒并移除出芽中心区域存在的脉络膜组织（使用快捷键 “F1”）（图 2A, B）。
注意：将魔棒工具的容差范围设置为 20–30%。
- 使用自由选择工具去除图像背景 （图 2C）。进入 “图像 | 调整 | 阈值 (Ctrl/Shift/T)”，利用阈值功能将微血管出芽结构与背景及周边区域区分开来 （图 2D）。
- 点击 “F2”，系统将显示汇总结果。点击 “保存” 以保存选定区域的图像，并将其保存在与原始图像相同的文件夹中，以备后续参考。
- 测量完一组样本后，复制记录的数据用于数据分析。
注意：也可通过带有比例尺的图像，使用 “分析 | 设置标尺” 功能测量面积（µm²）。
