体外研究眼微血管增殖的脉络膜出芽实验

摘要

来源：Tomita, Y., 等. 眼微血管新生的离体脉络膜出芽实验方法。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了脉络膜出芽的ex vivo模型的建立过程，用于研究眼微血管的血管生成。该实验方法包括在特定条件下培养含有附着于巩膜和视网膜色素上皮的脉络膜组织的小鼠眼球组织外植体，以促进脉络膜微血管的出芽。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备

1. 在500 mL含血清的完全经典培养基中加入5 mL青霉素/链霉素（10000 U/mL）以及5 mL和10 mL市售补充剂。先将培养基分装为每份50 mL。
   注意：避免将任何培养基倒回原储备液中，以防污染。
2. 将一份完全经典培养基置于冰上。
3. 使用70%乙醇清洁解剖显微镜、镊子和剪刀。
4. 准备两个细胞培养皿（10 cm），一个放置在解剖显微镜下，另一个置于冰上；每个培养皿中加入10 mL完全经典培养基。

2. 实验步骤（图1）

1. 使用腹腔注射75-100 mg/kg的氯胺酮和7.5-10 mg/kg的赛拉嗪，在出生后（P）20天左右处死C57BL/6J小鼠。解剖前将眼球置于冰上含有完全经典培养基的容器中保存。
2. 去除眼球周围的结缔组织（肌肉和脂肪组织）以及视神经。
3. 使用显微剪刀在角膜缘后方约0.5 mm处做环形切割，移除角膜/虹膜复合体、玻璃体和晶状体。
4. 从切口边缘向视神经方向做一条1 mm长的垂直切口，并切割出一条宽约1 mm的环形组织带。分离该复合体的中央区与周边区，用镊子将视网膜从RPE/脉络膜/巩膜复合体上剥离下来。
5. 将周边部脉络膜组织带置于冰上含有完全经典培养基的容器中保存；分离另一只眼球并重复上述步骤，获得第二条组织带。
6. 将环形组织带切成6个大小相近的方形小块（约1 mm × 1 mm）。
   注意：切勿触碰任何边缘。
7. 根据制造商说明解冻基底膜提取物（BME）。向24孔细胞培养板每孔中心加入30 μL BME，确保BME液滴在孔底形成凸起的穹顶状，且不接触孔壁。
   注意：BME应在冰箱中过夜解冻。解冻后任何时候均需置于冰上。
8. 将组织放置于BME的中央位置。
   注意：不要压平脉络膜外植体；通常让组织在BME内自然展开。组织的方向（巩膜面朝上或朝下）不影响实验结果。
9. 将培养板置于37 °C孵育10分钟，使凝胶固化。
10. 每孔加入500 μL完全经典培养基。
11. 每隔一天更换一次经典培养基（500 μL/孔）。3天后可在显微镜下观察到脉络膜出芽现象。
    注意：如需进行生长因子处理，先让组织饥饿培养4小时。将待试化合物用低生长因子培养基稀释（增强比例为1:200，而非1:50）。

3. SWIFT-脉络膜计算机量化方法（图2）

注意：采用了一种计算机化方法来测量生长血管所覆盖的面积。在进行定量分析之前，需要准备一个适用于ImageJ软件的宏插件。

1. 在 ImageJ 中打开脉络膜出芽图像，并通过灰度检查 “图像 | 类型 | 8 位”。
2. 进入 “图像 | 调整 | 亮度/对比度 (Ctrl/Shift/C)”，优化对比度。
3. 使用魔棒工具勾勒并移除出芽中心区域存在的脉络膜组织（使用快捷键 “F1”）（图 2A, B）。
   注意：将魔棒工具的容差范围设置为 20–30%。
4. 使用自由选择工具去除图像背景 （图 2C）。进入 “图像 | 调整 | 阈值 (Ctrl/Shift/T)”，利用阈值功能将微血管出芽结构与背景及周边区域区分开来 （图 2D）。
5. 点击 “F2”，系统将显示汇总结果。点击 “保存” 以保存选定区域的图像，并将其保存在与原始图像相同的文件夹中，以备后续参考。
6. 测量完一组样本后，复制记录的数据用于数据分析。
   注意：也可通过带有比例尺的图像，使用 “分析 | 设置标尺” 功能测量面积（µm²）。

结果

图1：脉络膜出芽实验的示意图。
首先将眼球摘除，并在距角膜缘约0.5 mm的后方进行环形切割。去除角膜、虹膜、晶状体和玻璃体。然后从眼杯边缘向视神经方向做一条1 mm的切口。再在切口边缘后方约1.0 mm处进行环形切割，分离出该环形组织带及其周围区域。将该组织带切成约1 mm × 1 mm的小片，嵌入BME中。随后在显微镜下观察来自脉络膜的微血管出芽。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AnaSed（赛拉嗪）	AKORN	59339-110-20
基底膜提取物（BME）Matrigel	BD Biosciences	354230
细胞培养皿	NEST	704001	10cm
含血清和CultureBoost的完全经典培养基	Cell systems	4Z0-500
200 Proof乙醇	Pharmco	111000200	用于配制70%
Kimwipes纸巾	Kimberly-Clark	06-666
显微镜	ZEISS	Axio Observer Z1
青霉素/链霉素	GIBCO	15140	10000 U/mL
组织培养板（24孔）	Olympus	25-107
VetaKet CIII（氯胺酮）	AKORN	59399-114-10