植物雌激素雌激素活性筛选的雌激素受体-报告基因活性检测

摘要

来源：Fender, E. 等，利用基于细胞的雌激素受体β报告基因检测法筛选植物雌激素。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了一种基于细胞的报告基因检测方法，用于测定植物来源化合物的雌激素活性。具有类似雌激素活性的化合物可模拟雌激素与雌激素受体结合，从而启动下游报告酶基因的转录。该报告酶在反应中产生生物发光，指示化合物的雌激素活性。

方案

1. 人雌激素受体β转染实验

注意：检测方案第1天需使用无菌技术和层流罩。

1. 制备17β-雌二醇的标准曲线稀释液。
   1. 将细胞复苏培养基和化合物筛选培养基（CSM）从冷冻储存中取出，并在37 °C水浴中解冻。
   2. 标记微量离心管为中间产物1和中间产物2（INT1，INT2）以及1-8。
   3. 在INT1中加入995 μL CSM，INT2中加入615 μL CSM，1号管中加入900 μL CSM，2-8号管中各加入600 μL CSM。将8号管置于一旁备用。
   4. 将5 μL 100 μM 17β-雌二醇储备液转移至INT1中。弃去枪头。涡旋振荡。
   5. 每次转移前，用移液器冲洗3次，然后将10 μL液体从INT1转移至INT2。弃去枪头。
   6. 用移液枪冲洗3次，然后从INT2中转移100 μL至1号管，弃去枪头。从1号管转移300 μL至2号管。重复此操作，依次处理3至7号管。将7号管中的300 μL弃入废液容器。8号管为空白对照（Zero），不加入雌二醇。微孔板上标准品的最终浓度分别为：400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487 和 0 pM 雌二醇。
2. 制备样品化合物。
   1. 涡旋混匀样品。
   2. 取4 μL以DMSO溶解的各植物样品，加入496 μL CSM中，配制成含0.8% DMSO的溶液。
3. 快速解冻报告细胞。
   1. 从37 °C水浴中取出细胞复苏培养基管，用70%乙醇消毒管外表面。
   2. 从-80 °C保存条件下取出报告细胞，通过将10 mL预热的CRM加入冻存细胞管中进行解冻。
   3. 关闭报告细胞管，将其转移至37°C水浴中孵育5-10分钟。
   4. 从水浴中取出报告细胞悬液管。轻轻反复倒置细胞管数次，以打散细胞团块，获得均匀的细胞悬液。用70%乙醇清洁管壁表面。
4. 检测板接种。
   1. 使用多通道移液器将100 μL报告细胞悬液加入每个孔中。
   2. 将100 μL样品以每组三个重复分装至相应的检测孔中。
   3. 将培养板放入37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中₂ 22-24 小时培养箱培养.
5. 在避光冰箱中过夜解冻检测底物和检测缓冲液，以准备第二天的实验。
6. 在培养板孵育即将结束前，从冰箱中取出检测试剂和检测缓冲液，置于低光照区域，待其恢复至室温。待溶液达到室温后，轻轻颠倒混匀每根管数次，以确保溶液充分混匀。
   1. 孵育即将结束前，将检测试剂缓冲液的全部内容物倒入检测试剂底物管中，配制成荧光素酶检测试剂。轻轻混匀，避免产生泡沫。
   2. 孵育结束后，将板倒置，将内容物弃入适当的废液容器中。轻轻将板在干净的吸水纸上拍打，以去除孔中残留的液滴。
   3. 每孔加入 100 μL 荧光素酶检测试剂。将检测板在室温下静置 15 分钟。切勿振荡培养板。
7. 使用96孔板读数仪定量检测发光信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 µL 移液器
20 µL 移液器
200 µL 移液器
37 °C 水浴
37 °C、加湿、含 5% CO2 的培养箱
70% 乙醇
分析天平
细胞培养级层流罩
二甲基亚砜
一次性无菌培养基容器
滴滤系统
锥形瓶			125 mL 和 250 mL
高效液相色谱级甲醇
人 ERβ 报告基因检测系统，1 × 96 孔板规格检测	Indigo Biosciences	IB00411	检测试剂盒 — 可分析 24 个样品及标准曲线
冷冻干燥机
多通道移液器
旋转摇床
酶标仪（发光检测）			例如 Bioteck Synergy HTX
旋转蒸发仪
圆底烧瓶			50 mL 和 300 mL
无菌微量离心管或无菌多通道培养基容器
无菌吸头			200 µL 和 1000 µL
Whatman 1 号滤纸
Whirl-pak 袋			无菌聚乙烯袋