植物雌激素雌激素活性筛选的雌激素受体-报告基因活性检测

摘要

来源：Fender, E. 等，利用基于细胞的雌激素受体β报告基因检测法筛选植物雌激素。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了一种基于细胞的报告基因检测方法，用于测定植物来源化合物的雌激素活性。具有类似雌激素活性的化合物可模拟雌激素与雌激素受体结合，从而启动下游报告酶基因的转录。该报告酶在反应中产生生物发光，指示化合物的雌激素活性。

方案

1. 人雌激素受体β转染实验

注意：检测方案第1天需使用无菌技术和层流罩。

1. 制备17β-雌二醇的标准曲线稀释液。
   1. 将细胞复苏培养基和化合物筛选培养基（CSM）从冷冻储存中取出，并在37 °C水浴中解冻。
   2. 标记微量离心管为中间产物1和中间产物2（INT1，INT2）以及1-8。
   3. 在INT1中加入995 μL CSM，INT2中加入615 μL CSM，1号管中加入900 μL CSM，2-8号管中各加入600 μL CSM。将8号管置于一旁备用。
   4. 将5 μL 100 μM 17β-雌二醇储备液转移至INT1中。弃去枪头。涡旋振荡。
   5. 每次转移前，用移液器冲洗3次，然后将10 μL液体从INT1转移至INT2。弃去枪头。
   6. 用移液枪冲洗3次，然后从INT2中转移100 μL至1号管，弃去枪头。从1号管转移300 μL至2号管。重复此操作，依次处理3至7号管。将7号管中的300 μL弃入废液容器。8号管为空白对照（Zero），不加入雌二醇。微孔板上标准品的最终浓度分别为：400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487 和 0 pM 雌二醇。
2. 制备样品化合物。
   1. 涡旋混匀样品。
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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 µL 移液器
20 µL 移液器
200 µL 移液器
37 °C 水浴
37 °C、加湿、含 5% CO2 的培养箱
70% 乙醇
分析天平
细胞培养级层流罩
二甲基亚砜
一次性无菌培养基容器
滴滤系统
锥形瓶			125 mL 和 250 mL
高效液相色谱级甲醇
人 ERβ 报告基因检测系统，1 × 96 孔板规格检测	Indigo Biosciences	IB00411	检测试剂盒 — 可分析 24 个样品及标准曲线
冷冻干燥机
多通道移液器
旋转摇床
酶标仪（发光检测）			例如 Bioteck Synergy HTX
旋转蒸发仪
圆底烧瓶			50 mL 和 300 mL
无菌微量离心管或无菌多通道培养基容器
无菌吸头			200 µL 和 1000 µL
Whatman 1 号滤纸
Whirl-pak 袋			无菌聚乙烯袋