来源：Padros, J. 等，利用时间分辨 Förster 共振能量转移检测法测定人细胞内源性磷酸化 STAT 蛋白。J. Vis. Exp. (2021)。
本视频介绍了利用标记有供体和受体荧光基团的特异性抗体，通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测法来测定内源性蛋白质磷酸化水平。该技术旨在检测细胞裂解液中目标蛋白的磷酸化状态。
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方法文章
时间分辨福斯特共振能量转移法用于监测细胞内蛋白质磷酸化
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 细胞培养
- 将细胞置于加湿的 37 °C/5% CO2 培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（HeLa和A431细胞）或添加15% FBS的RPMI培养基（U266B1细胞）。培养细胞至其融合度达到70–80%，随后用胰蛋白酶消化并传代或用于实验分析。
注意： 培养基中含有酚红。在进行实验前，所有细胞系均未进行无血清饥饿处理。
2. 使用贴壁细胞双板检测方案进行刺激剂或抑制剂滴定
注意：本实验流程描述了如何通过测试化合物的稀释系列生成浓度-反应曲线，以确定刺激剂或抑制剂的效价。
- 细胞接种
- 将细胞以预优化的密度（STAT3 和 STAT6 均为每孔 40,000 个 HeLa 细胞；STAT5 为每孔 75,000 个 A431 细胞）用适当的培养基重悬，每孔加入 50 µL 至 96 孔组织培养处理板中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
注意：最佳细胞密度和培养孵育时间需自行确定。
- 将细胞以预优化的密度（STAT3 和 STAT6 均为每孔 40,000 个 HeLa 细胞；STAT5 为每孔 75,000 个 A431 细胞）用适当的培养基重悬，每孔加入 50 µL 至 96 孔组织培养处理板中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 测试化合物的稀释
- 在聚丙烯 96 孔板中，将测试化合物（半对数间隔稀释）用无血清培养基进行系列稀释，制备成中间浓度为 2 倍的稀释系列，覆盖 12 个孔。
注意：建议至少进行两次重复，采用 12 个浓度点、半对数间隔的浓度-反应曲线，以准确估算 EC50 或 IC50 值。 - 或者，对于疏水性、可溶于二甲基亚砜（DMSO）的测试化合物，可先在 100% DMSO 中进行初始稀释，再将稀释后的化合物系列加入无血清培养基中。
注意：在使用 DMSO 作为溶剂进行测试化合物滴定前，必须先确定检测体系对 DMSO 的耐受浓度。需确保处理组与未处理组细胞之间的溶剂浓度相等。此外，在测试化合物系列稀释时，整个稀释系列中的溶剂浓度应始终保持一致。
- 在聚丙烯 96 孔板中，将测试化合物（半对数间隔稀释）用无血清培养基进行系列稀释，制备成中间浓度为 2 倍的稀释系列，覆盖 12 个孔。
- 细胞处理
- 进行细胞刺激时，每孔加入 50 µL 仅含无血清培养基的溶液（未处理细胞）或含刺激剂（2 倍浓度）的溶液。
- 在预优化的时间内于室温（RT）或 37 °C 下孵育（STAT3：干扰素（IFN）α2b，室温刺激 20 分钟；STAT5：表皮生长因子（EGF），室温刺激 10 分钟；STAT6：白细胞介素（IL）-4，室温刺激 20 分钟）。随后进入第 2.4 节操作。
注意：最佳孵育温度需自行确定。 - 进行细胞抑制时，每孔加入 25 µL 仅含无血清培养基的溶液（未处理细胞）或含抑制剂（4 倍浓度）的溶液。
- 在预优化的时间内于室温或 37 °C 下孵育（STAT3 和 STAT6：JAK 抑制剂 1，室温孵育 30 分钟；STAT5：厄洛替尼，室温孵育 15 分钟）。
- 每孔加入 25 µL 仅含无血清培养基的溶液（未处理细胞）或含刺激剂（4 倍浓度）的溶液，刺激剂浓度为其 EC80。
- 在预优化的时间内于室温或 37 °C 下孵育（孵育条件与步骤 2.3.2 相同）。
- 细胞裂解
- 按照制造商说明，配制试剂盒专用的 1 倍补充裂解缓冲液。
注意：必须将 100 倍磷酸酶抑制剂混合液稀释至终浓度为 1 倍，加入 1 倍裂解缓冲液中。1 倍补充裂解缓冲液含有 1 mM 氟化钠、2 mM 正钒酸钠和 2 mM β-甘油磷酸钠。无需添加其他磷酸酶抑制剂，应避免使用。不建议使用试剂盒以外的裂解缓冲液或磷酸酶抑制剂，因其可能含有干扰检测的成分。 - 小心吸弃并移除细胞培养上清液。
- 立即每孔加入 50 µL 1 倍补充裂解缓冲液。
注意：裂解缓冲液体积（25–50 µL）可进行优化。 - 在室温下振荡孵育 30 分钟（使用转速为 400 rpm 的轨道摇床，中等振荡强度）。
注意：裂解孵育时间（30–60 分钟）可进行优化。裂解产物可立即用于靶蛋白检测，或于 -80 °C 冻存。
- 按照制造商说明，配制试剂盒专用的 1 倍补充裂解缓冲液。
- 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测
- 按照制造商说明，在 1 倍检测缓冲液中配制 4 倍抗体检测混合液。
- 在此转移步骤中，小心地将 96 孔培养板中的 15 µL 细胞裂解液移取至白色低体积 384 孔微孔板的对应孔中。
- 分别向不同的检测孔中加入 15 µL 阳性对照裂解液和 15 µL 1 倍裂解缓冲液（阴性对照）。
- 向每个检测孔中加入 5 μL 4 倍抗体检测混合液（检测磷酸化蛋白时使用 Eu-Ab1/FR-Ab2，检测总蛋白时使用 Eu-Ab3/FR-Ab4）。
- 用封板膜覆盖微孔板，并在室温下孵育 1 小时至过夜，具体时间取决于检测类型（参见相应的技术数据表）。
注意：每种检测和细胞系的最佳读板时间需进行优化。该微孔板可多次读数，不会对检测性能产生负面影响。 - 移除粘性封板膜，并在支持 TR-FRET 检测的微孔板读数仪上读取数据。
注意：推荐使用滤光片型荧光计，尽管部分单色仪仪器也可使用。请确认已安装适用于 TR-FRET 的光学模块（滤光片和反射镜）。使用 320 nm 或 340 nm 激发波长激发铕螯合物。分别在 615 nm（或 620 nm）和 665 nm 处读取信号，以检测供体铕和受体荧光染料的发射光。仪器设置取决于具体读数仪型号。本文所示数据采用基于灯源的激发方式，延迟时间为 90 µs，积分时间为 300 µs，每孔闪光 100 次。然而，磷蛋白 STAT4 检测采用激光激发，以获得更高的信噪比（S/B）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔微孔板，透明，平底，聚苯乙烯，组织培养处理，无菌 | Corning | 3595 | 本产品用于双板检测方案中的细胞培养。也可使用其他细胞培养用96孔板 |
| 384孔微孔板，白色，低体积 | PerkinElmer | 6007290 | 本产品用于双板或单板检测方案中的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测。也可使用其他低体积白色384孔板 |
| A431细胞系 | ATCC | CRL-1555 | |
| 粘性微孔板密封膜 | PerkinElmer | 6050185 | |
| Dulbecco’改良Eagle培养基（DMEM） | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET技术兼容含酚红的培养基 |
| EnVision Xcite 多功能酶标仪 | PerkinElmer | 2104-0020A | 该检测可在配备TR-FRET功能的多种酶标仪上进行 |
| HeLa细胞系 | ATCC | CCL-2 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI） | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET技术兼容含酚红的培养基 |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Wisent | 325-542-CL | |
| 超纯水 | NA | NA | 使用Milli-Q级水（18 MΩ·cm）稀释裂解缓冲液和检测缓冲液 |
