基于发光法的检测方法用于评估受试化合物对神经元的神经毒性

摘要

来源：Wahlestedt, C.，等，利用人神经前体细胞衍生神经元进行神经突生长检测及神经毒性评估。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍了一种基于发光法的检测方法，用于评估促进神经突生长的小分子化合物对人源神经前体细胞（hNPC）分化而来的神经元存活率的神经毒性。该检测通过测定细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平——细胞活力的指标——来评价受试化合物处理后的神经毒性效应。

方案

所有涉及人类受试者的操作均按照机构、国家及国际的人类福祉指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核

1. 人类神经前体细胞（hNPCs）的分离与培养

1. 将脑组织放入一个 100 mm 的培养皿中，使用镊子小心去除脑膜。
2. 将脑组织转移至一个 50 mL 的锥形管中，用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻倒置管子清洗两次。
3. 将脑组织放入一个新的 50 mL 锥形管中，加入细胞解离溶液（见 材料表）和 DNase I（10 U/mL），在 37 °C 下孵育 10 分钟。
4. 向含有脑组织的管中加入 5 mL 神经元细胞培养基（见 材料表），通过 1000 µL 移液枪头反复吹打 20 至 30 次，机械解离神经球，制成单细胞悬液。
5. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞滤网过滤，以去除细胞团块。
6. 将单细胞悬液接种至通气的 T-25 培养瓶中，加入 5–10 mL 神经元细胞培养基，并补充  表 1 中详述的组分。
   1. 通过 0.2 µm 滤器过滤肝素溶液以实现灭菌。不含维生素 A 的 B-27 添加剂是一种无血清添加剂，用于培养神经前体细胞和干细胞，且不会诱导其分化。
      注意：

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素	Gibco	15240062
B27	Thermo	17504001
B27 - 不含维生素A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	细胞冻存容器，可在-80°C冰箱中实现标准化的-1°C/分钟程序性降温冻存
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	含10% DMSO的冻存培养基
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂
肝素	Calbiochem	375095
层粘连蛋白	Sigma	L2020-1MG
L-抗坏血酸	Sigma	A92902-25G
mFreSR	StemCell Technologies	5854	无血清冻存培养基，专为人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞冻存设计
N2	Gibco	17502048
Nunc 384孔聚苯乙烯白色微孔板	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
聚-L-赖氨酸	Sigma	P5899-5MG
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	含蛋白酶和胶原酶的细胞解离试剂
Neurobasal培养基	Gibco	21103049