基于发光法的检测方法用于评估受试化合物对神经元的神经毒性

摘要

来源：Wahlestedt, C.，等，利用人神经前体细胞衍生神经元进行神经突生长检测及神经毒性评估。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们介绍了一种基于发光法的检测方法，用于评估促进神经突生长的小分子化合物对人源神经前体细胞（hNPC）分化而来的神经元存活率的神经毒性。该检测通过测定细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平——细胞活力的指标——来评价受试化合物处理后的神经毒性效应。

方案

所有涉及人类受试者的操作均按照机构、国家及国际的人类福祉指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核

1. 人类神经前体细胞（hNPCs）的分离与培养

1. 将脑组织放入一个 100 mm 的培养皿中，使用镊子小心去除脑膜。
2. 将脑组织转移至一个 50 mL 的锥形管中，用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻倒置管子清洗两次。
3. 将脑组织放入一个新的 50 mL 锥形管中，加入细胞解离溶液（见 材料表）和 DNase I（10 U/mL），在 37 °C 下孵育 10 分钟。
4. 向含有脑组织的管中加入 5 mL 神经元细胞培养基（见 材料表），通过 1000 µL 移液枪头反复吹打 20 至 30 次，机械解离神经球，制成单细胞悬液。
5. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞滤网过滤，以去除细胞团块。
6. 将单细胞悬液接种至通气的 T-25 培养瓶中，加入 5–10 mL 神经元细胞培养基，并补充  表 1 中详述的组分。
   1. 通过 0.2 µm 滤器过滤肝素溶液以实现灭菌。不含维生素 A 的 B-27 添加剂是一种无血清添加剂，用于培养神经前体细胞和干细胞，且不会诱导其分化。
      注意：人神经前体细胞（hNPCs）来源于人工流产胎儿的胎儿脑组织。培养 7–10 天后，神经干细胞（NSCs）会形成悬浮生长的神经球克隆，而其他细胞类型则以单细胞形式悬浮或贴附于培养瓶底部。分离得到的 hNPCs 可在悬浮培养中以神经球形式传代数月。

2. hNPCs 的传代

1. 收集含有悬浮类球体（包括大小神经球）的培养基，并转移至50 mL锥形管中。
   注意：由于未知原因，神经球的传代时间存在差异，通常为7天至30天不等。但一般而言，当神经球直径超过700–900 µm时即需进行传代。此时神经球中心开始变暗，被认为是细胞死亡率较高的标志。
2. 以300–400 × g 离心3分钟，使神经球沉淀。
3. 小心吸除上清液，然后将神经球浸入500 µL解冻后的细胞解离试剂中（参见 材料表）。
   1. 将细胞解离试剂按每管500 µL分装至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。为避免酶活性丧失，应在室温下放置或在37 °C水浴/金属浴中加热5分钟以解冻细胞解离试剂。
4. 根据神经球的密度和大小，将浸没的神经球在37 °C孵育5–15分钟。
5. 向含有神经球的50 mL锥形管中加入5–10 mL预热的培养基，于300–400 × g 离心5分钟，使神经球沉淀。
6. 吸除上清液后，用1000 µL移液器在2 mL培养基中轻柔吹打数次，直至所有神经球完全分散为单细胞悬液。
   注意：解离过程肉眼可见。解离前，神经球呈球状结构；加入解离试剂并反复吹打后，将形成单细胞状态。
   1. 计数后接种单细胞，每T-25培养瓶接种200万至300万个细胞，加入10 mL培养基。
7. 每3天换液一次，更换一半培养基。
   1. 将培养瓶倾斜，使其底部一角着地，保持该姿势约1–2分钟，使神经球自然沉降。随后将移液管插入已沉降神经球上方的培养基中，轻柔吸除一半培养基。解离后的细胞在培养2至3天后可重新聚集成球。

3. 冻存人神经前体细胞（hNPCs）

1. 通过将DMSO加入培养基中，配制终浓度为10%（v/v）的细胞冻存液；或针对敏感细胞类型使用市售的冻存培养基（见 材料表）。
2. 将培养液转移至50 mL锥形管中，静置使类球体依靠重力自然沉降，挑出较大的类球体，并用200或1000 µL移液器吸头将其转移至新的50 mL锥形管中用于传代。
   注意：直径大于900 µm的神经球被视为大神经球，直径小于500 µm的则被视为小神经球。
3. 将剩余的神经球在300–400 × g 条件下离心3分钟，小心弃去上清液。
4. 将最多100个神经球重悬于1 mL冻存试剂中，并转移至冻存管。
5. 于–80 °C冻存盒中过夜保存（见 材料表），次日转移至液氮中进行长期保存。
   注意：建议冻存小至中等大小的神经球（直径小于900 µm），避免冻存大尺寸神经球（直径大于900 µm）或单细胞。为减少解冻过程中细胞损伤，可将解冻后的神经球接种于较小的T25培养瓶中，以维持较高的细胞密度。

4. 神经毒性评估

注意：测试化合物的细胞毒性在384孔板中进行评估（见 材料表），使用发光法细胞活力检测（见 材料表）。人神经前体细胞（hNPCs）的制备方法与“hNPCs的分化与处理”部分所述方法相同，仅略有修改。随后，使用微孔板读板仪检测发光法细胞活力检测试剂产生的发光信号。该发光信号强度与细胞内ATP浓度成正比，而ATP浓度又与每孔中活细胞的数量成正比。

1. 包被
   1. 在384孔板的每孔中加入30 µL聚-L-赖氨酸（PLL）。
   2. 在室温下孵育1小时。
   3. 用PBS洗涤2次。
   4. 在室温下晾干（约30分钟）。
   5. 在384孔板的每孔中加入30 µL层粘连蛋白（laminin，50 µg/mL）。
   6. 在37 °C下孵育2小时。
   7. 用PBS洗涤2次。
      注意：包被好的384孔板可在4 °C下保存1个月。
2. 细胞接种
   1. 将20,000个单细胞神经球用25 µL分化培养基接种至384孔板的每孔中。
   2. 在37 °C下孵育5天。
   3. 5天后，加入5 µL终浓度为6倍的待测化合物溶液处理细胞24小时（使每孔终体积为30 µL）。
3. 细胞活力检测
   1. 在384孔板的每孔中加入30 µL发光型细胞活力检测试剂。
      注意：加入的发光型细胞活力检测试剂体积应与孔中现有液体体积相等。使用前将试剂解冻并平衡至室温。
   2. 在板式振荡器上振荡2分钟（以充分混匀并诱导细胞裂解）。
   3. 以300–400 × g 离心30秒，使混合物沉降至孔底。
   4. 将384孔板置于避光处，在室温下孵育10分钟（以稳定发光信号）。
   5. 使用微孔板读数仪记录发光值。
      注意：细胞活力检测需设置适当的对照，包括以10 µM终浓度的Velcade作为阳性对照，以及含DMSO（终浓度0.1%或0.2%）的HBSS作为阴性对照。

表1. 配制100 mL培养基所需的组分

用量	组分
100 µL	EGF (20 ng/mL)
100 µL	FGF (10 ng/mL)
2 mL	B-27, 不含维生素A (50X)
1 mL	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 (100X) (参见材料表)
4 µL	肝素 (2 μg/mL)
96.8 mL	神经元细胞培养基 (参见材料表)

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素-抗真菌素	Gibco	15240062
B27	Thermo	17504001
B27 - 不含维生素A	Thermo	12587010
BDNF	PeproTech	450-02
BSA	Sigma	A8531
CellTiter-Glo	Promega	G7572
CoolCell	Corning	432000	细胞冻存容器，可在-80°C冰箱中实现标准化的-1°C/分钟程序性降温冻存
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930	含10% DMSO的冻存培养基
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO	Sigma	34869-100ML
EGF	Gibco	PHG0311
FGF	Gibco	PHG6015
GDNF	PeproTech	450-10
Glutamax	Gibco	35050061	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺补充剂
肝素	Calbiochem	375095
层粘连蛋白	Sigma	L2020-1MG
L-抗坏血酸	Sigma	A92902-25G
mFreSR	StemCell Technologies	5854	无血清冻存培养基，专为人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞冻存设计
N2	Gibco	17502048
Nunc 384孔聚苯乙烯白色微孔板	Thermo	164610
PBS	Thermo	10010-049
聚-L-赖氨酸	Sigma	P5899-5MG
StemPro Accutase	Gibco	A1110501	含蛋白酶和胶原酶的细胞解离试剂
Neurobasal培养基	Gibco	21103049