<table><tbody><tr><td>18 mm 圆形盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>细胞松弛素 D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>请参见参考文献 8 和 15</td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫荧光检测法评估靶蛋白对神经突生长的影响

来源：Chan, W., W., R. 等。<a href='https://app.jove.com/v/60031'>基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite 生长研究方法</a>。J. Vis. Exp. (2019)。
在本视频中，我们展示了一种基于EGFP的免疫荧光检测方法，用于评估目的蛋白对原代皮层神经元 neurite 生长的影响。原代神经元被转染了荧光蛋白EGFP和目的蛋白，随后进行免疫检测，以研究目的蛋白对 neurite 生长的作用。

来源：Chan, W., W., R. 等。一种基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite outgrowth 研究检测方法。J. Vis. Exp.

发育中的神经元通过神经突向外生长，从细胞体延伸出细胞质突起，以形成树突和轴突，这些结构对于神经元之间的通讯至关重要。
为了研究目标蛋白对神经突生长的影响，取一块多孔板，其底部带有聚-D-赖氨酸包被的盖玻片。该盖玻片表面附着有源自胚胎大鼠脑组织的原代皮层神经元培养物。
使用含有两种质粒的混合物处理神经元——一种是编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒，另一种是编码目标蛋白的质粒，将这两种质粒与合适的转染试剂混合后使用。
转染试剂可促进质粒进入细胞。
转染后，两种质粒均得到表达，产生绿色荧光蛋白和目标蛋白。EGFP的表达使共转染的细胞呈现绿色荧光。
具有促进神经突生长潜力的靶蛋白可启动细胞信号传导，从而促进细胞骨架的重排，进而导致神经元突起及其延伸结构的形成。
吸弃废液，用多聚甲醛固定细胞。使用红色荧光标记的抗靶蛋白抗体对细胞进行复染，该抗体可特异性结合表达的靶蛋白，使细胞产生额外的红色荧光。
从培养皿中移除盖玻片，并在荧光显微镜下观察。
共转染细胞若表现出双色荧光信号，则其神经元突起长度超过缺乏红色荧光的细胞，从而证实目标蛋白对神经突起生长具有促进作用。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养两天后，将EGFP和目的蛋白质粒DNA以及转染试剂分别加入两个1.5毫升离心管中进行稀释，然后将两者混合。通过将转染混合物加入孔板中，用EGFP载体转染细胞。
24小时后，用37摄氏度的PBS洗涤细胞，并在室温避光条件下用PBS中的4%多聚甲醛固定10分钟。
孵育结束后，用新鲜的 PBS 洗涤固定后的细胞，每次洗涤重复三次，每个样本取一滴荧光封片液滴于显微镜玻片上。然后，小心地将带有样本的盖玻片转移至封片液上，使样本面朝向玻片。
为了观察神经突的生长，选择落射荧光显微镜上的 40 倍物镜，点击 “开始”，从每次转染的至少 40 个完整的 EGFP 阳性神经元中采集图像。
当所有新生突起成像完成后，使用 ImageJ 软件中的 NeuronJ 插件打开所采集的图像，并测量每个神经元从胞体到生长锥顶端的最长突起的长度。然后，利用软件分析所获得的数据，以确定靶向蛋白对突起生长的影响。

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科研

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

生物学技术

Assay Techniques

分析技术

Immunoassays

免疫测定

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

免疫荧光测定评估靶蛋白对神经突生长的影响

993 次观看. 发育中的神经元通过神经突生长将细胞质过程从细胞体延伸出来，发育出树突和轴突，这对于神经元到神经元的通讯至关重要。 要研究靶蛋白对神经突生长的影响，请取一个底部有聚-D-赖氨酸涂层盖玻片的多孔板。盖玻片的表面有源自胚胎大鼠大脑的初级皮质神经元的粘附培养物。 用含有两种质粒的混合物处理神经元——一种编码增强型绿色荧光蛋白的 EGFP 质粒?...

免疫荧光检测法评估靶蛋白对神经突生长的影响

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姓名	公司	目录编号	评论
18 mm 圆形盖玻片	Thermo Scientific	CB00180RA	使用前灭菌
细胞松弛素 D	Invitrogen	PHZ1063	溶于 DMSO
EndoFree 质粒大提试剂盒	QIAGEN	12362
荧光封片介质	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			请参见参考文献 8 和 15
PBS 片剂	Gibco	18912014
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P7280
刮勺	Sigma-Aldrich	S4147
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Gibco	25300062