分裂荧光素酶互补测定以鉴定特定的蛋白质-蛋白质相互作用

Abstract

来源:Wiertelak， W. et.al.， 使用分裂荧光素酶互补测定法证明高尔基体驻留 III 型膜蛋白形成的异源复合物。J. Vis. Exp.（2020 年）

该视频演示了用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的分裂荧光素酶互补测定。在该测定中，目标蛋白质被标记在荧光素酶的小片段和大片段上。当蛋白质相互作用时，大片段和小片段结合形成活性酶复合物，在特定底物存在下，释放出可以测量的明亮发光。

Protocol

1. 表达质粒瞬时转染到细胞中

1. 通过胰蛋白酶消化收获贴壁HEK293T细胞培养物，并将细胞重悬于专用的完全生长培养基中。将细胞 （2 x 10⁴/100 μL/孔） 接种到底部透明的白色 96 孔板上。调整孔总数以适应所有测试的组合和对照，包括重复。
   注意:尝试仅使用板的内部 60 个孔，以尽量减少热转移并避免过夜蒸发。强烈建议使用聚-D-赖氨酸包被的板，例如材料表中所示的板，否则，细胞可能会在后续洗涤步骤中分离。
2. 在标准条件（37°C，5% CO₂）中将细胞培养过夜。
3. 第二天，用所需的表达质粒组合转染细胞。
   对于
   1. 每种构建体，在无血清培养基中将表达质粒稀释至 6.25 ng/μL（参见材料表）。
   2. 以适当的脂质体与 DNA 比例添加脂质体转染试剂，并根据制造商的说明进行孵育。
   3. 将 8 μL 脂质:DNA 混合物添加到指定孔中。通过轻轻旋转混合板的内容物。这导致两种表达构建体的转染速率为 50 ng/孔。
4. 在标准条件（37°C，5%CO₂）下将细胞培养20-24小时><。 注意:细胞培养时间较长可能会导致更高水平的融合蛋白表达，这可能会促进片....

Materials