双分子荧光素酶互补分析法鉴定特异性蛋白质-蛋白质相互作用

摘要

来源：Wiertelak, W. 等人., 利用分裂荧光素酶互补实验展示高尔基体驻留型III型膜蛋白形成的异源复合物 视觉实验杂志. (2020)

本视频演示了分裂荧光素酶互补检测法，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。在该检测中，目标蛋白质分别与荧光素酶的小片段和大片段融合。当蛋白质发生相互作用时，大片段和小片段会结合形成具有活性的酶复合物，在特定底物存在的情况下，该复合物会释放出强烈的发光信号，可被检测和测量。

方案

1. 将表达质粒瞬时转染入细胞

1.  通过胰酶消化收获贴壁生长的HEK293T细胞，并将细胞重悬于专用的完全培养基中。将细胞以每孔100 µL含2 × 10⁴个细胞的密度接种至透明底、白色侧壁的96孔板中。根据所有待测组合及对照组（包括重复样本）的数量调整所需孔数。
   注意：建议仅使用板内侧的60个孔，以减少温度波动并避免过夜培养时发生蒸发。强烈推荐使用多聚-D-赖氨酸包被的板，如材料表中所列产品；否则，细胞可能在后续洗涤步骤中脱落。
2. 在标准条件下（37 °C，5% CO₂）培养细胞过夜。
3. 次日，用所需组合的表达质粒转染细胞。
   1. 将表达质粒溶于无血清培养基（见材料表），每种质粒稀释至6.25 ng/µL。
   2. 按适当的脂质-DNA比例加入脂质转染试剂，并根据生产商说明书进行孵育。
   3. 向指定孔中加入8 µL脂质:DNA混合物，通过轻轻旋转混匀孔内液体。最终每孔中两种表达质粒的转染量均为50 ng。
4. 在标准条件（37 °C，5% CO₂）下继续培养细胞20–24小时。
   注意：延长培养时间可能导致融合蛋白表达水平升高，从而促进片段间的非特异性结合。

2. 培养基更换

1. 次日，将每孔中的条件培养基更换为 100 µL 无血清培养基。确保换液过程中细胞未发生脱落。
   注意：此步骤应在加入呋喃嗪工作液前 2–3 小时完成。去除血清可最大限度减少呋喃嗪自发光引起的背景信号。

3. 腔肠素工作液的制备

1. 测量前，将1体积的呋喃甲酰胺与19体积的稀释缓冲液混合（20倍稀释）。
   注意：所需配制的呋喃甲酰胺工作液的总体积取决于待分析的孔数（呋喃甲酰胺工作液以1:5的比例加入细胞培养基中，因此，向先前已加入100 µL无血清培养基的每孔中加入25 µL呋喃甲酰胺工作液）。
2. 向指定孔中加入呋喃甲酰胺工作液（25 µL/孔）。用手轻轻振荡或使用轨道摇床轻轻混匀（例如，300–500 rpm下振荡15秒）。

4. 测量发光

1. 将培养板放入化学发光微孔板检测仪中。
   1. 对于需在 37 °C 下进行的实验，将培养板在指定温度下平衡 10–15 分钟。
2. 选择需要分析的孔。
3. 设定积分时间为 0.3 秒，读取化学发光信号。根据需要，持续监测化学发光长达 2 小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液			细胞培养
贴壁哺乳动物细胞系			细胞培养
BioCoat Poly-D-Lysine 96 孔白色/透明平底 TC 处理微孔板，带盖	Corning	356651	塑料器皿
细胞培养离心机			塑料器皿
细胞培养添加剂（热灭活胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素）			细胞培养
CO2 培养箱			设备
编码目标蛋白但未标记 NanoBiT 片段的表达质粒			检测
FuGENE HD 转染试剂	Promega	E2311	检测
GloMax Discover 微孔板读数仪（或其它化学发光微孔板读数仪）	Promega	GM3000	设备
适用于所用细胞系的生长培养基			细胞培养
标准分子克隆所需材料与试剂（细菌、耐热 DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA 连接酶、核酸纯化相关材料与试剂）			检测
NanoBiT MCS 起始系统	Promega	N2014	该试剂盒包含可在不同方向上将目标蛋白与 NanoBiT 片段融合的载体，以及编码 HaloTag 蛋白与 SmBiT 融合蛋白的对照质粒和一对阳性对照质粒。
Nano-Glo 活细胞检测系统	Promega	N2011	该试剂盒包含呋喃嗪（furimazine），其为可在活细胞中检测 NanoLuc 活性的底物，以及专用稀释缓冲液。
Opti-MEM I 低血清培养基，无酚红	Gibco	11058021	细胞培养
轨道摇床			设备