脑组织裂解液中目标蛋白水平的电化学发光检测

摘要

来源：Steinkellner, H.，等，基于电化学发光的 MeCP2 蛋白变体检测方法。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们演示了用于定量不同样品中目标蛋白水平的电化学发光免疫分析法。该检测基于电化学反应中产生的发光现象。所发射光的强度与样品中目标蛋白的含量成正比。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. MeCP2-ECLIA 检测方案

1. 洗涤液、封闭缓冲液和检测稀释液的制备（第1天）
   1. 向1 L PBS中加入500 µL Tween 20，配制含0.05% Tween 20的PBS溶液，充分混匀，并标记为“洗涤液”。
      注意：确保仅使用新鲜配制的洗涤缓冲液。
   2. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制3% 封闭剂A（材料表）的封闭溶液。轻轻搅拌混匀，过滤除菌后置于冰箱中保存，最多可使用两周。
   3. 将5 mL封闭溶液加入10 mL PBS中，配制检测稀释液（含1% 封闭剂A的PBS）。
2. 高结合板包被
   1. 取出一块96孔多阵列单点高结合板。
      注意：高结合板比具有疏水表面的标准板具有更高的结合能力和更宽的动态范围。
   2. 将单克隆小鼠抗MeCP2抗体置于冰上解冻，取0.67 µL抗体与4 mL PBS混合（PBS中抗体稀释比例为1:6,000）。涡旋混匀抗体溶液，并将试管标记为“包被液”。
   3. 使用多通道移液器将25 µL包被液小心加入每孔底部角落，此方法称为溶液包被法。轻轻敲击96孔板各侧，确保包被液覆盖每个孔的底部。
   4. 用粘性封口膜密封板孔，在4 °C冰箱中过夜孵育（12−16 h）。
3. 封闭（第2天）
   1. 从冰箱中取出板，撕去封口膜。
   2. 将抗体包被液甩入废液桶中，并将板在纸巾上轻拍，彻底去除各孔中的包被液。
   3. 每孔加入125 µL封闭液。再次密封板，并将其置于轨道微孔板振荡器上。
   4. 在室温下以800 rpm持续振荡孵育90分钟。
4. 标准品与样品的制备
   1. 在孵育期间，制备MeCP2和/或TAT-MeCP2蛋白标准品及各类样品。
      注意：用于标准品稀释的裂解缓冲液必须与分析样品所用的裂解缓冲液相同。
   2. 从-80 °C取出一瓶MeCP2和/或TAT-MeCP2蛋白储备液（250 µg/mL）、小鼠脑组织裂解液和HDF裂解液，在冰上解冻。
   3. 根据表1在洁净离心管中稀释标准储备液（MeCP2和/或TAT-MeCP2）。
   4. 按以下方式在裂解缓冲液中稀释样品：每25 µL裂解缓冲液中加入1−20 µg小鼠脑组织裂解液，或0.25−1 µg HDF裂解液。每种样品需准备足够体积，以完成三复孔检测。
5. 加入标准品与样品溶液
   1. 将封闭液甩入废液桶中，并将板在纸巾上轻拍，彻底去除各孔中的封闭液。
   2. 使用150 µL洗涤液对板进行3次洗涤，每次加入洗涤液后立即移除。
   3. 使用单通道移液器将25 µL标准品和样品加入每孔底部角落。
   4. 密封板孔，在室温下以800 rpm持续振荡孵育4小时。
6. 未标记检测抗体
   1. 将多克隆兔抗MeCP2抗体置于冰上解冻。在检测稀释液中按1:6,000比例稀释抗体。
   2. 将标准品和样品甩入废液桶中，并将板在纸巾上轻拍。
   3. 使用150 µL洗涤液对板进行3次洗涤，每次加入洗涤液后立即移除。
   4. 使用多通道移液器向每孔加入25 µL未标记检测抗体。密封板孔，在室温下以800 rpm持续振荡孵育1小时。
7. 特异性偶联抗体
   1. 从冰箱中取出特异性二抗（材料表），置于冰上。在检测稀释液中按1:666.67比例稀释抗体，并轻轻混匀。
   2. 将未结合的未标记二抗甩入废液桶中，并将板在纸巾上轻拍。
   3. 使用150 µL洗涤液对板进行3次洗涤，每次加入洗涤液后立即移除。
   4. 使用多通道移液器向每孔加入25 µL特异性偶联抗体（材料表）。密封板孔，在室温下以800 rpm持续振荡孵育1小时。
8. 读板
   1. 将未结合的偶联抗体（材料表）甩入废液桶中，并将板在纸巾上轻拍。
   2. 使用150 µL洗涤液对板进行3次洗涤。
   3. 加入150 μL含表面活性剂和三丙胺（作为发光共反应物）的1× 基于Tris的Gold读板缓冲液（材料表）。采用反向移液技术，避免产生气泡。
   4. 将板置于微孔板检测平台（材料表）上，立即开始测量。使用96孔板检测模式的仪器设置。
   5. 通过电化学发光检测系统（材料表）内置的CCD相机采集电化学发光信号，记录信号计数，该数值对应于相对光单位（RLU），并与光强度成正比。
      注意：电化学刺激下，结合于碳电极上的钌标记物在620 nm处发射发光信号。使用仪器配套软件（材料表）分析数据。

表1：0至1,800 ng/mL的标准系列。

标准品	浓度	稀释方法
标准品 1	1,800 ng/mL	1.08 µL 标准品储备液 + 148.92 µL 裂解缓冲液
标准品 2	600 ng/mL	50 µL 标准品 1 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 3	200 ng/mL	50 µL 标准品 2 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 4	66.67 ng/mL	50 µL 标准品 3 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 5	22.22 ng/mL	50 µL 标准品 4 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 6	7.41 ng/mL	50 µL 标准品 5 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 7	2.47 ng/mL	50 µL 标准品 6 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 8	0.82 ng/mL	50 µL 标准品 7 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 9	0.27 ng/mL	50 µL 标准品 8 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 10	0 ng/mL	150 µL 裂解缓冲液

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TAT-MeCP2 融合蛋白	自主生产		细胞处理
MSD 封闭剂 A	Meso Scale Diagnostics	R93BA-4	封闭剂
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	洗涤液
兔源多克隆抗 MeCP2 抗体	Eurogentec S.A.	定制设计	抗体
鼠源单克隆抗 MeCP2 抗体，克隆 Mec-168，纯化免疫球蛋白	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	抗体，包被液
Multi-Array 96 孔板	Meso Scale Diagnostics	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA 检测方案
二抗，兔抗 MeCP2	Eurogentec S.A.	定制	抗体
二抗，兔抗 MeCP2	Merck	07-013	抗体
人源 MeCP2 重组蛋白 (P01)	Abnova Corporation	H00004204-P01	细胞处理
含表面活性剂的金读板缓冲液 T (1x)	Meso Scale Diagnostics	R92TG	MeCP2 ECLIA 检测方案
MSD SECTOR 成像仪 2400	Meso Scale Diagnostics	I30AA-0	MeCP2 ECLIA 检测方案
Discovery Workbench 4.0	Meso Scale Discovery		软件
Dulbecco’s PBS（无菌）	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	样品制备，洗涤液，包被液
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	提取缓冲液