用于定量脑裂解物中靶蛋白水平的电化学发光测定

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查

1. MeCP2-ECLIA 协议

1. 洗涤液、封闭缓冲液和测定稀释液的制备（第 1 天）
   1. 将 500 μL 吐温 20 加入 1 升 PBS 中，在 PBS 溶液中制备 0.05% 吐温 20，剧烈混合并标记为"洗涤液"。
      注意:确保仅使用新鲜制备的洗涤缓冲液。
   2. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 3% 阻断剂 A（材料表）的封闭溶液。轻轻搅拌混合，过滤消毒，并保存在冰箱中，最多使用两周。
   3. 向 10 mL PBS 中加入 5 mL 封闭液，制备测定稀释液（PBS 中的 1% 阻断剂 A）。
2. 高结合板的涂层
   1. 取出一个 96 孔多阵列单点高结合板。
      注意:高结合板具有更大的结合载量，因此比具有疏水表面的标准板具有更大的动态范围。
   2. 在冰上解冻单克隆小鼠抗 MeCP2 抗体，并将 0.67 μL 抗体与 4 mL PBS（PBS 中的 1:6,000 抗体稀释液）混合。涡旋抗体溶液以充分混合并将试管标记为"涂层溶液"。
   3. 使用多通道移液器在每个孔的底角小心分配 25 μL 涂层溶液;这称为溶液涂层方法。轻轻敲击 96 孔板的每一侧，以确保涂层溶液覆盖每个孔的底部。
   4. 用粘合箔密封板，并将板在冰箱中于 4 °C 孵育过夜（12-16 小时）。
3. 阻塞（第 2 天）
   1. 从冰箱中取出盘子并取下箔纸。
   将
   2. 抗体包被溶液轻弹到废纸篓中，将其取出，然后在纸巾上轻敲板，以去除孔中的所有包被溶液。
   3. 每孔加入 125 μL 封闭溶液。再次密封板并将其放在轨道微孔板振荡器上。
   4. 在室温下以 800 rpm 的转速持续摇动板孵育板 90 分钟。
4. 标准品和样品的制备
   1. 在孵育期间，准备 MeCP2 和/或 TAT-MeCP2 蛋白标准品和各种样品><。 注意:用于标准稀释的裂解缓冲液必须与分析样品中使用的裂解缓冲液相同。
   2. 从 -80 °C 中取出一小瓶 MePC2 和/或 TAT-MeCP2 蛋白原液 （250 μg/mL）、小鼠脑裂解物和 HDF 裂解物。将它们在冰上解冻。
   3. 根据表 1 在干净的试管中稀释标准储备溶液（MeCP2 和/或 TAT-MeCP2）。
   4. 在裂解缓冲液中稀释样品，如下所示:每 25 μL 裂解缓冲液 1-20 μg 小鼠脑裂解物，每 25 μL 裂解缓冲液 0.25-1 μg HDF 裂解液。准备足够体积的每个样品以一式三份进行分析。
5. 添加样品和标准溶液
   将
   1. 封闭溶液轻弹到废液篓中，将其取出，然后在纸巾上轻敲板以去除孔中的所有封闭溶液。
   2. 加入洗涤液并立即将其取出，用 150 μL 洗涤液洗涤板 3 次。
   3. 使用单通道移液器将 25 ul 标准品和样品添加到孔的底角。
   4. 密封板并在室温下以 800 rpm 恒定摇动孵育板 4 小时。
6. 未标记检测抗体
   1. 在冰上解冻多克隆兔抗 MeCP2 抗体。在测定稀释剂溶液中以 1:6,000 的比例稀释抗体。
   将
   2. 标准品和样品弹入废液篓中，然后用纸巾轻敲板子，取出标准品和样品。
   3. 加入洗涤液并立即将其取出，用 150 μL 洗涤液洗涤板 3 次。
   4. 使用多通道移液器向每个孔中加入 25 μL 未标记的检测抗体。密封板并在室温下以 800 rpm 的恒定摇动孵育 1 小时。
7. 特异性偶联抗体
   1. 从冰箱中取出特异性二抗（材料表），放在冰上。在测定稀释剂溶液中以 1:666.67 的比例稀释抗体并轻轻混合。
   将
   2. 游离的未标记二抗轻弹到废纸篓中，取出自由的未标记二抗，然后在纸巾上轻敲板。
   3. 加入洗涤液并立即将其取出，用 150 μL 洗涤液洗涤板 3 次。
   4. 使用多通道移液器向每个孔中加入 25 μL 特异性偶联抗体（材料表）。密封板并在室温下以 800 rpm 的恒定摇动孵育 1 小时。
8. 读取板
   1. 将游离偶联抗体（材料表）轻弹到废纸篓中，将其取出，然后用纸巾轻敲板。
   2. 用 150 μL 洗涤液洗涤板 3 次。
   3. 加入 150 μL 1x Tris 基 Gold 读取缓冲液（材料表）和含有三丙胺作为共反应物的表面活性剂，用于向板中发光。使用反向移液技术避免任何气泡。
   4. 将板放在微孔板检测平台（材料表）上并立即开始测量。使用 96 孔板采集的设置。
   5. 通过电化学发光检测系统中的内置 CCD 相机捕获电化学发光信号（材料表）并记录信号计数，这些信号计数对应于相对光单位 （RLU），与光强度成正比><。 注意:在电化学刺激下，与碳电极结合的钌标记物发出 620 nm 的发光光。使用仪器随附的软件（材料表）分析数据。

表 1:0 至 1,800 ng/mL 的标准系列。