用于靶基因中插入缺失突变检测的数字滴定聚合酶链式反应

摘要

来源：Carballar-Lejarazú, R.，等。利用数字微滴PCR检测基因修饰按蚊群体中的插入缺失突变。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了数字滴液聚合酶链式反应在鉴定DNA样本中插入缺失突变（indel突变）中的作用。ddPCR具有高精度和高灵敏度，能够准确且一致地检测样本中罕见的突变，即使其含量极低也能识别。该技术可鉴定并定量基因组不同区域中的插入缺失突变，为突变机制及其功能影响提供重要见解。

方案

1. 数字滴定PCR反应与液滴生成准备

1. 使用荧光计定量DNA。
   注意：对于缺失检测实验，建议每个反应使用3,000–30,000个单倍体基因组拷贝，该范围旨在检测NHEJ事件。实验采用HEX标记探针，该探针结合靶向切割位点的野生型序列，若靶位点发生缺失或插入，则探针无法退火（即“脱落”），从而指示NHEJ变异的存在。
2. 根据单倍体基因组质量和提取DNA的浓度计算拷贝数。具体方法为：将提取DNA的浓度乘以所用体积，得到总DNA质量，再除以单倍体基因组质量。确保加入的体积在1–10 µL之间。如必要，进行稀释以达到推荐的单倍体基因组拷贝数范围。
   注意：每只成年冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的单倍体基因组质量估计为0.27 pg。
3. 设计引物和探针。设计正向和反向寡核苷酸引物，其引物熔解温度（Tm）应在55–60 °C范围内，分别位于gRNA靶位点的5'端和3'端外侧，扩增产物长度为150–400 bp。
   1. NHEJ检测用HEX（六氯荧光素）标记探针：设计一条长约15–20 bp、与靶位点互补的寡核苷酸序列，在5'端添加HEX探针，3'端添加BHQ1（黑孔淬灭剂1）。水解探针的Tm应比引物Tm高3–10 °C。
   2. 参考野生型检测用FAM（6-羧基荧光素）标记探针：设计一条长约15–20 bp、与远离靶位点（约25 bp）的保守基因组区域互补的寡核苷酸序列，在5'端添加FAM探针，3'端添加BHQ1。水解探针的Tm应比引物Tm高3–10 °C。

2. PCR 反应体系的准备

1. 配制25 µL ddPCR样品混合液，包含以下组分：探针用ddPCR预混液（不含UTP）：12.5 µL，正向和反向引物（10 µM）：各1 µL，HEX/FAM探针（10 µM）：各0.625 µL，DNA：1–5 µL（3,750–37,500个单倍体基因组拷贝），加水至总体积25 µL。
2. 通过涡旋振荡或反复吹打（上下移液20次）充分混匀反应体系。
   注意：若反应体系位于96孔板中，建议将全部液体反复吹打20次以代替涡旋，避免产生气泡。
3. 短暂离心样品，使混合液沉降至管底或孔底。
   注意：确保反应体系处于室温条件下再进行液滴生成。每张芯片中需为额外/未使用的孔准备1份ddPCR混合液（每张芯片含8个孔）。

3. 液滴生成

1. 使用 50 µL 多通道移液器，将 20 µL ddPCR 样品混合液加入芯片的中排孔中（图 1A，顶部）。
2. 将 70 µL 油相加入底部排孔中。将 20 µL 1x ddPCR 超混合液加入未使用的孔中。
   注意：避免产生气泡。
3. 将垫圈放置到位，仅接触边缘部分，避免接触中心凹陷区域（图 1B）。
4. 将板牢固地放入液滴生成仪中，并关闭盖子以启动运行。
5. 使用多通道移液器，将 40 µL 乳化混合液从芯片的上排孔（图 1A，底部）转移至 96 孔板中。
   1. 以 45–30° 角度吸取液体样品 3–5 秒。以 45° 角度将混合液缓慢排出超过 3 秒，排至孔壁使其沿壁滴下。可将移液器压至第二档（完全排出），以排尽全部液体。
6. 使用铝箔热封膜，在 180 °C 下密封 5 秒。

4. PCR

1. 将密封的反应板放入热循环仪中（图1C），若遵循NHEJ Drop-Off操作指南，则设置以下推荐的PCR反应条件：
   1. 95 °C 初始变性 10 分钟。
   2. 设置 40 个循环：94 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 1 分钟，60 °C 延伸 2 分钟。
   3. 在 98 °C 保持 10 分钟。
   4. 在 4 °C 保持。
      注意：针对特定引物和探针组合的退火温度可通过温度梯度优化。所有步骤的升温/降温速率均设为 2 °C/s。PCR反应条件应根据具体的实验设计和仪器设置进行相应调整。

5. 液滴读取

1. 将微孔板牢固地放入液滴读取仪中，确保 A-1 孔位于左上角（该角为光滑圆角，其余三个角为直角）（图 1D）。
2. 在程序中设置微孔板：指定 FAM 为已知参考通道，HEX 为未知通道（图 2A）。
3. 运行液滴读取实验，选择直接定量模式。实验结束后，将实验类型更改为 Drop-Off（DOF）以进行分析（图 2A）。

结果

图1：实验装置与操作流程。（A）微滴生成用卡盒的准备。（上图）样品加入卡盒中间排孔，油相加入底部排孔。（下图）微滴生成后，顶部排孔中充满乳化形成的微滴。（B）已装入样品并用垫圈密封的卡盒置于微滴生成仪中。（C）96孔板经铝箔密封后放入热循环仪中。（D）96孔板置于微滴读取仪中，金属盖板已锁紧以固定板位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<em><强>试剂</strong></em>
ddPCR探针超级混合液（不含dUTP）	伯乐（Bio-Rad）	1863024
EDTA（pH 8.0）	Invitrogen	AM9260G
PCR级水			任何经过认证的PCR级水均可使用
蛋白酶K 20 mg/mL	赛默飞世尔科技	AM2546
<em><强>材料</strong></em>
ddPCR 96孔板	Bio-Rad	12001925
Droplet Generator DG8 微滴发生器盒与垫圈	伯乐（Bio-Rad）	1864007
探针用液滴生成油	Bio-Rad	1863005
荧光探针（例如 FAM/HEX 探针）	Sigma-Aldrich	N/A	探针具有实验特异性，可从任意认证供应商处购买。
正向与反向寡核苷酸引物	Sigma-Aldrich	N/A	引物具有实验特异性，可从任何经认证的供应商处购买。
<em><强>仪器设备</strong></em>
C1000 Touch 梯度PCR仪	伯乐（Bio-Rad）	1851148	可使用其他具有梯度功能和深孔模块的Thermo PCR仪