梯度聚合酶链式反应确定最佳退火温度

摘要

来源：Tsujimoto, H. 等人， 利用高分辨率熔解分析检测蚊子中CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失突变 埃及伊蚊. J. Vis. Exp. (2021).

本视频展示了用于优化引物退火温度的梯度聚合酶链式反应，该方法可在各孔中设置梯度退火温度。通过扩增产物的产量来确定不同退火温度的效果，从而优化反应条件。

方案

1. 单核苷酸多态性（SNPs）扫描、HRMA 引物设计及引物验证

1. 在野生型实验室品系蚊子中鉴定 SNP
   1. 选择目标外显子以破坏多肽的正常翻译。
      注意：目标位点应靠近起始密码子，或位于对蛋白质功能至关重要的关键残基区域。外显子越短（例如 ≤200 个碱基），越难靶向和分析。应避免在外显子边界附近进行编辑，因为这会迫使高分辨率熔解分析（HRMA）引物之一跨越内含子或位于内含子中。这是不理想的，因为这些区域的 SNP 频率通常要高得多。
   2. 引物设计
      1. 访问 NCBI Blast - Primer Blast 网站，将选定的 外显子 序列复制粘贴到页面顶部的输入框中 | 选择 PCR 产物大小（确保其涵盖大部分外显子）| 选择 物种。
      2. 点击 高级参数 | Opt （用于 PCR 产物 Tm 值），输入 60 （设定最适温度为 60 °C）| 获取 引物。其余参数保持默认设置。
   3. 从野生型实验室品系中提取基因组 DNA（gDNA）。保留 10 只蚊子，用 CO₂ 麻醉，并将其置于冰上的培养皿中以保持其不活动状态。准备 10 个离心管，每管加入 0.5 µL DNA 释放试剂和 20 µL 稀释缓冲液，两者均来自 材料表 中推荐的 DNA 释放试剂盒。
   4. 使用镊子从一只蚊子上取下一条腿，放入含有稀释 DNA 释放试剂的对应离心管中（来自步骤 1.1.3），确保腿完全浸没在溶液中。对剩余蚊子重复此操作，每次操作前用 70% 乙醇擦拭镊子。
   5. 将含有腿组织的溶液在室温下孵育 2–5 分钟，然后在 98 °C 下孵育 2 分钟，随后冷却，同时准备 PCR 反应。
      注意：含有释放出的 gDNA 的板可在 -20 °C 下保存，本实验流程可在此处暂停。
   6. 准备 10 个离心管，每管含 10 µL 2x PCR 主混合液，引物终浓度为 0.5 µM，用分子级水补足至终体积 20 µL，并向每管中加入 1 µL 稀释后的样品。按照以下循环参数进行 PCR：98 °C 5 分钟，40 个循环（98 °C 5 秒，60 °C 30 秒，72 °C 每 kb 20 秒）；最后在 72 °C 延伸 1 分钟。
   7. 使用酶处理降解残留的 PCR 引物并去磷酸化多余的 dNTP，或使用柱纯化试剂盒纯化 PCR 产物。随后进行样品测序。
   8. 分析每个电泳图谱中是否存在双峰/模糊碱基，并使用相应的简并碱基代码手动校正每个序列中的碱基判读。
      注意：此步骤必须在多序列比对前完成，因为碱基判读软件通常会选择更显著的峰作为“真实”碱基，从而错误地显示无 SNP 存在。
   9. 使用 材料表 中列出的比对软件 SeqMan Pro 或其他开源比对软件（如 ClustalW 或 T-Coffee）进行多序列比对。
      1. 打开比对软件 | 点击 添加序列 | 选择所需序列并点击 添加 | 所有序列选择完成后，点击 完成。
      2. 点击 组装 以执行比对。点击 Contig 1 打开比对结果，分析比对情况并识别 SNP（图 1）。
         注意：作为步骤 1.1.3–1.1.6 的替代方案，可从批量样品（来自 >10 个个体）中提取的基因组 DNA 直接进行 PCR。测序后的扩增子可直接分析电泳图谱中是否出现双峰形式的 SNP，但稀有 SNP 的检测将更加困难。
   10. 设计 3–5 条单导向 RNA（sgRNA），避免包含上述已鉴定 SNP 的区域，遵循所述实验方案。

2. HRMA 引物设计

1. 使用 mFold 检测外显子序列在 PCR 过程中可能形成的二级结构。
   1. 进入 UNAFold 网络服务器 | 点击 mFold | 在下拉菜单中点击 Applications | DNA Folding Form。
   2. 在输入框中输入 序列名称，并粘贴 外显子 序列。
   3. 将折叠温度更改为 60 °C；在 离子条件 中，将 [Mg⁺⁺] 更改为 1.5，并将单位切换为 mM；点击 Fold DNA。
   4. 在 输出 部分，结构 1 下方，点击 pdf 以打开环形结构图。
2. 前往 NCBI Blast - Primer Blast 进行引物设计。
3. 将步骤 1.1 中通过测序确定的选定外显子序列（包含最少数量 SNP 或无 SNP 的序列）复制并粘贴到页面顶部的输入框中。
4. 使用符号 < > 标记并排除包含 SNP 的序列、靶位点以及可能形成二级结构的区域。
5. 选择 PCR 产物大小 在 80 至 150 bp 之间，并选择 物种。
   注意： 较大的片段大小也可成功使用（约 300 bp）。然而，较长的扩增子可能会降低在仅有一个或少数几个碱基对差异的序列之间的检测灵敏度。
6. 点击 Get Primers。选择 2–3 对引物进行测试（理想情况下，引物结合位点应距离任何 CRISPR 靶位点 ≥20–50 bp）。

3. 引物验证

1. 使用单一个体的基因组DNA进行梯度PCR。
   1. 配制主混合液，并在单独的离心管中留出一份样本作为无模板对照（NTC）。将模板加入剩余的主混合液中，混匀后分装至96孔板。
   2. 按照以下扩增程序进行反应：98 °C 预变性30 s，34个循环（98 °C 变性10 s，55–65 °C 退火30 s，72 °C 延伸15 s）；最后72 °C 延伸10 min。
   3. 根据以下参数生成熔解曲线：变性步骤为95 °C 1 min，退火60 °C 1 min，熔解曲线检测范围为75 °C 至95 °C，以0.2 °C 递增，每个温度点保持10 s。
      注意：仅可选用产生单一熔解峰曲线的退火温度。

结果

图1： SNP鉴定。 来自野生型的AaeZIP11片段的多序列比对示意图。红色部分为SNP位点，绿色部分为无SNP的片段；建议在无SNP区域进行sgRNA和引物设计。缩写：SNP = 单核苷酸多态性；sgRNA = 单导向RNA；LVP = 利物浦品系。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇			水中 70% 乙醇溶液
96 孔 PCR 和实时 PCR 板	VWR	82006-636	用于获取基因组 DNA（来自蚊子腿部）
96 孔板模板			自制打印，用于基因型记录
Bio Rad CFX96	Bio Rad		具有梯度和高分辨率熔解分析（HRMA）功能的 PCR 仪
Diversified Biotech 试剂储液槽	VWR	490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	New England Biolabs	E1050S
玻璃培养皿	VWR	89001-246	150 mm × 20 mm
Nunc 聚烯烃丙烯酸酯封膜，Thermo Scientific	VWR	37000-548	与 96 孔  PCR 板配合使用，用于获取基因组 DNA
Phire 动物组织直接 PCR 试剂盒（不含采样工具）	Thermo Fisher	F140WH	用于获取基因组 DNA 并进行 PCR 扩增
Precision Melt Analysis 软件	Bio Rad	1845025	用于蚊子 DNA 样本的基因分型及双链 DNA 热变性特性的分析（参见实验步骤 3.3）
单通道移液器	Gilson
Phire 动物组织直接 PCR 试剂盒（不含采样工具）	Thermo Fisher	F140WH	用于获取基因组 DNA 并进行 PCR 扩增
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene 软件		用于多序列比对
单通道移液器	Gilson