双重数字PCR同时定量双基因标志物

摘要

来源：Cao, Y., 等. 一种用于同时定量水中肠球菌属和人粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法. J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。

方案

1. 检测混合液的制备

1. 使用分子级水将所有引物配制成100 µmol/L的储存液，使用TE pH 8缓冲液将探针配制成储存液 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP]。
   注意：两种靶标的探针使用材料与设备列表中所示的不同荧光染料进行荧光标记。
2. 按每项反应配制主混合液：混合12 µl数字PCR混合液（2×储存液，参见材料与设备列表）、0.216 µl正向引物和反向引物各一份、0.06 µl荧光探针各一份，以及5.016 µl无核酸酶水（终浓度：每种引物900 nM，每种探针250 nM）。上下吹吸至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。
3. 将18 µl主混合液（来自步骤1.2）移入普通PCR管或孔板中，并加入6 µl DNA模板（按前述方法提取），以制备用于生成液滴的检测混合液。若样品需设重复，每孔中加入36 µl主混合液和12 µl DNA模板，并在对应位置的重复孔中留空。同时设置阳性对照（参见材料与设备列表）和无模板对照（NTC）（即以分子级水作为模板）。
   注意：阳性对照用于确保检测反应正常进行，NTC用于确保孔板内无污染，并为后续数据分析设定荧光本底基线。首次使用者建议同时使用未稀释和稀释的DNA样品。

2. 液滴生成与PCR板设置

1. 使用多通道移液器将检测混合液上下吹打约15次以充分混匀。确保移液器吸头始终浸没在液体中，避免在混合液中产生过多气泡。
2. 将1号卡盒（含8个孔）插入白色卡盒支架中，并扣紧支架。此时1号卡盒已牢固固定，生成液滴过程中不会松动。使用多通道移液器，轻柔地将20 µl检测混合液转移至卡盒中标记为“Sample”的中间位置，避免引入气泡。
3. 向卡盒左侧（标记为“Oil”）加入70 µl液滴生成油。
4. 将垫圈盖在卡盒上，确保垫圈平整，并被卡盒边缘的4个卡扣均匀固定。按下液滴生成仪上亮起绿色的按钮以打开仪器，放入卡盒，然后再次按下绿色按钮关闭仪器。
   注意：门关闭后，按钮将变暗，此时门无法重新打开，液滴生成立即开始，持续约1分钟。
5. 若需进行超过8个反应，在液滴生成过程中，将2号卡盒放入第二个白色卡盒支架中，并参照1号卡盒的方法进行准备，以节省总设置时间。
6. 当按钮由暗变绿，表示液滴生成完成，此时打开液滴生成仪的门。取出含有1号卡盒的白色支架，暂放一旁，并将2号卡盒放置到液滴生成仪中。
7. 取下1号卡盒上的垫圈并丢弃。轻柔地将生成的液滴（约40 µl）从卡盒的第三列（标记为“Droplets”）全部转移至最终的PCR板中（保持室温），用于后续热循环。
   注意：不要松开白色卡盒支架，以免破坏新生成的液滴；仅在液滴完全转移至最终板后，再打开卡盒支架。
8. 对其他样品重复步骤2.1–2.7。
9. 当所有液滴均转移至最终PCR板后，在板上覆盖可穿刺的铝箔膜，并将板放入板封仪。将封膜仪温度设为180 °C，按下“Play”键，封膜10秒。

3. 热循环与液滴读取

1. 将密封好的酶标板置于热循环仪中，所用热循环仪需兼容步骤2.7中最终使用的PCR板，且升降温速率为2.0 °C/sec。
2. 运行热循环程序如下：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 94 °C 变性 30 秒，60 °C 退火延伸 60 秒，最后在 98 °C 延伸 10 分钟（可选：最终保存于 4 或 15 °C）。
3. 循环结束后，将培养板转移至液滴读取仪，以自动测量每个孔中各液滴的荧光信号。或者，在液滴读取前可将培养板在 4 °C 条件下保存最多 3 天。进行读取前，需确保液滴已恢复至室温。
   1. 打开配套软件以设置液滴读取。在默认的“设置”菜单中，该菜单包含一个空的96孔板示意图，双击A1孔，打开包含三个部分的菜单：“样本”、“检测1”和“检测2”。
   2. 在“样本”部分，将样本编号输入标有“名称”的框中，然后按回车键或勾选右侧标记为“应用”的复选框。接着，点击标有“实验”的下拉菜单，选择“RED”（稀有事件检测），然后点击回车。
   3. 转至标记为“Assay 1”的部分，在“Name”部分填写该检测名称例如 肠球菌）并按回车键。在下方标有“Type”的框中，点击下拉菜单，选择“Channel 1 Unknown”，然后按回车键。
   4. 转至标记为“Assay 2”的部分。在“Name”部分填写该检测的名称例如 HF183），然后按回车键。在下方标有“类型”的框中，点击下拉菜单，选择“通道2未知样本”，然后按回车键。此时，步骤3.3.2至3.3.4中的所有信息均已显示在A1孔中。
   5. 为所有后续含有液滴的孔命名。为节省总设置时间，可按住“Shift”或“Ctrl”键，以同时选择多个孔。
   6. 当平板的数字图像与实物平板一致时，点击菜单右下角的“OK”。在平板示意图上方新出现的菜单中，在“Template”部分选择“Save As”，为平板命名并保存。
   7. 在屏幕左侧点击“Run”，然后在弹出的“Run Options”窗口中选择合适的染料组。数据采集将随即开始，并在软件中实时显示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低吸附微量管	Costar	3207	用于试剂、样品的储存及主混合液的制备
无核酸酶水	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 缓冲液	FisherSci	BP2473-100
硬壳96孔板	BioRad	HSP-9601	用于初始主混合液及样品接种
铝制密封膜	BioRad	359-0133	用于密封样品板
液滴生成仪	BioRad	186-3002
液滴生成油	BioRad	186-3005
芯片	BioRad	186-4008
DG8芯片支架	BioRad	186-3051
垫圈	BioRad	186-3009
20 µL 吸头	Rainin	GP-L10F	用于将样品/主混合液转移至芯片
200 µL 吸头	Rainin	GP-L200F	用于将液滴转移至最终的Twin.Tec板
Twin.Tec 96孔板	Eppendorf	951020320	用于最终液滴的热循环及读数
可穿刺热封箔	BioRad	181-4040	在热循环前密封Twin.Tec板
PX1 PCR板封膜仪	BioRad	181-4000	仅需热循环仪，无需光学检测
CFX96热循环仪	BioRad	CFX96 and C1000
QX100液滴读取仪	BioRad	186-3001
液滴读取油	BioRad	186-3004
液滴PCR预混液	BioRad	186-3024	即手稿中所述的数字PCR混合液
QuantaSoft软件（v1.3.2）	Quantasoft	QX100	用于查看、分析和导出ddPCR数据
肠球菌正向引物（Ent F1A）	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	可使用其他供应商
肠球菌反向引物（Ent R1）	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	可使用其他供应商
肠球菌探针（GPL813TQ）	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	可使用其他供应商，但荧光基团必须为FAM
HF183正向引物（HF183-1）	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	可使用其他供应商
HF183反向引物（BthetR1）	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	可使用其他供应商
HF183探针（BthetP1）	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	可使用其他供应商，但荧光基团必须为HEX（若使用VIC，则需选择适当的矩阵补偿）
阳性对照			由粪肠球菌基因组DNA与HF183标准质粒（从IDT订购）混合而成。有关粪肠球菌培养的详细方法E. faecalis及订购的HF183质粒序列，请参见Cao et al. 2015（doi:10.1016/j.watres.2014.12.008）。商业化的肠球菌DNA标准品（ATCC 29212Q-FZ）也可用于阳性对照，以替代实验室制备的E. faecalis基因组DNA。