用于同时定量双遗传标记物的双重数字 PCR

摘要

来源:Cao， Y.， et al.A 用于同时定量肠球菌属的双重数字 PCR 检测。和 Waters 中的人粪便相关 HF183 标志物。J. Vis. Exp.（2016 年）

在本视频中，我们演示了双重数字 PCR （ddPCR） 技术，该技术是对传统 PCR 技术的改进，可用于同时检测两种不同的遗传标记。将单个 PCR 反应分流成独立扩增的纳升大小的乳化液滴，并使用从液滴分数中检测不同颜色的荧光放大信号来计算目标序列的初始浓度。

方案

1. 测定混合物制备

1. 在分子级水中制备所有引物和在 TE pH 8 缓冲液 [Entero F1A、Entero R1、GPL813TQ;HF183-1， BthetR1， BthetP].
   注:两个靶标的探针用不同的荧光团进行荧光标记，如材料/设备清单所示。
2. 通过混合制备主混合物，每个计划的反应，12 μl 数字 PCR 混合物（2x 原液，参见材料/设备清单），每种正向和反向引物 0.216 μl，每种荧光探针 0.06 μl 和 5.016 μl 无核酸酶水（终浓度:每个引物 900 nM，每个探针 250 nM）。上下移液至少 10 次以混合，同时注意不要在溶液中引入气泡。
3. 将 18 μl 预混液（来自步骤 1.2）移液到常规 PCR 管或板中，混入 6 μl DNA 模板（如前所述提取）以制备用于产生液滴的测定混合物。如果一式两份运行样品，则向每个孔中移取 36 μl 预混液和 12 μl DNA 模板。将相应的复制孔留在板上。包括阳性对照（参见材料/设备列表）和无模板对照 （NTC）（即使用分子级水作为模板><）。 注意:阳性对照是必要的，以确保检测正常运行，而 NTC 是必要的，以确保板内没有污染，并在稍后的数据分析中设置荧光基线。建议初次使用的用户同时使用未稀释和稀释的 DNA 样品。

2. 液滴生成和 PCR 板设置

1. 通过使用多通道移液器上下吹打约 15 次来混合测定混合物。确保移液器吸头保持在液体内，以避免在混合物中产生过多的气泡。
2. 将小柱 1（包含 8 个孔）插入白色小柱支架中，然后咔嗒一声关闭小柱支架。小柱 1 现在已牢固就位，在产生液滴时无法从支架上脱落。使用多通道移液管，将 20 μl 检测混合物轻轻转移到标有"样品"的小柱的中间位置，不要引入气泡。
3. 将 70 μl 液滴发生油移液到墨盒左侧（标记为"油"）。
4. 用垫圈盖住墨盒，确保垫圈平整，并被朝向墨盒边缘的 4 个刻度均匀固定。按下液滴发生器上的绿色亮起按钮，打开并放置墨盒。再次按下绿灯按钮关闭发电机。
   注意:一旦门关上，按钮就会变暗，门无法重新打开，飞沫生成立即开始持续约 1 分钟。
5. 如果进行 8 个以上的反应，请将小柱 2 放入第二个白色小柱支架中，并在液滴生成过程中以与小柱 1 相同的方式进行制备，以节省总设置时间。
6. 当昏暗的按钮变为绿色表示液滴生成完成时，打开液滴发生器门。取下包含小柱 1 的白色小柱支架，将其放在一边，然后将小柱 2 放在液滴发生器上。
7. 从墨盒 1 中取出垫圈并丢弃。将总体积（约 40 μl）产生的液滴从小柱的第三列（标记为"Droplets"）轻轻转移到最终的 PCR 板（保持在室温下）上进行热循环><。 注意:请勿取消单击白色小柱支架，因为该作可能会破坏新生成的液滴;只有在液滴转移到最终板后才能打开小柱支架。
8. 对其他样品重复步骤 2.1-2.7。
9. 当所有液滴都进入最终的 PCR 板中时，在板顶部放置一个可刺穿的铝箔盖，并将其放在板密封机上。将封口机设置为 180 °C，按封口机上的"播放"键，然后密封 10 秒。

3. 热循环和液滴读数

1. 将密封板放在热循环仪上，该板与步骤 2.7 中使用的最终 PCR 板兼容，升温速度为 2.0 °C/秒。
2. 按如下方式运行热程序:在 95 °C 下运行 10 分钟，然后在 94 °C 下循环 30 秒，在 60 °C 下循环 60 秒，然后在 98 °C 下保持 10 分钟（可选:最终保持在 4 或 15 °C）。
3. 循环完成后，将板转移到 Droplet Reader 上，以自动测量每个孔中每个液滴的荧光。或者，在液滴读数前将板在 4 °C 下储存长达 3 天。在继续读取之前，请确保液滴处于室温下。
   1. 打开随附的软件以设置液滴读数。在包含空 96 孔板示意图的默认"设置"菜单中，双击 A1 孔以打开包含三个部分的菜单:"样品"、"分析 1"和"分析 2"。
   2. 在"样品"部分，在标有"名称"的框中输入样品 ID，然后按 Enter 键或选中右侧标有"应用"的框。接下来，单击标有"实验"的下拉菜单，选择"RED"（罕见事件检测），然后单击 Enter。
   3. 移至标有"检测 1"的部分。在"名称"部分填写检测（例如肠球菌）并点击回车。在下面标有"类型"的框中，单击下拉菜单并选择"通道 1 未知"，然后单击回车键。
   4. 移至标有"检测 2"的部分。在"名称"部分填写检测（例如 HF183）并点击回车。在下面标有"类型"的框中，单击下拉菜单并选择"通道 2 未知"，然后单击回车键。步骤 3.3.2 到 3.3.4 的所有信息现在都存在于 A1 孔中。
   5. 命名所有包含液滴的后续孔。为了节省总设置时间，请单击"Shift"或"Ctrl"，同时选择多个孔。
   6. 当印版的数字描述与物理印版相同时，按菜单右下角的"确定"。在板原理图顶部出现的新菜单中，在"模板"部分下选择"另存为"并命名并保存板。
   7. 在屏幕左侧，单击"Run"（运行）并在弹出的"Run Options"（运行选项）窗口中选择合适的染料组。数据收集启动并在软件中实时显示。

材料