双重数字PCR同时定量双基因标志物

摘要

来源：Cao, Y., 等. 一种用于同时定量水中肠球菌属和人粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法. J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。

方案

1. 检测混合液的制备

1. 使用分子级水将所有引物配制成100 µmol/L的储存液，使用TE pH 8缓冲液将探针配制成储存液 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP]。
   注意：两种靶标的探针使用材料与设备列表中所示的不同荧光染料进行荧光标记。
2. 按每项反应配制主混合液：混合12 µl数字PCR混合液（2×储存液，参见材料与设备列表）、0.216 µl正向引物和反向引物各一份、0.06 µl荧光探针各一份，以及5.016 µl无核酸酶水（终浓度：每种引物900 nM，每种探针250 nM）。上下吹吸至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。
3. 将18 µl主混合液（来自步骤1.2）移入普通PCR管或孔板中，并加入6 µl DNA模板（按前述方法提取），以制备用于生成液滴的检测混合液。若样品需设重复，每孔中加入36 µl主混合液和12 µl DNA模板，并在对应位置的重复孔中留空。同时设置阳性对照（参见材料与设备列表）和无模板对照（NTC）（即以分子级水作为模板）。
   注意：阳性对照用于确保检测反应正常进行，NTC用于确保孔板内无污染，并为后续数据分析设定荧光本底基线。首次使用者建议同时使用未稀释和稀释的DNA样品。....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低吸附微量管	Costar	3207	用于试剂、样品的储存及主混合液的制备
无核酸酶水	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 缓冲液	FisherSci	BP2473-100
硬壳96孔板	BioRad	HSP-9601	用于初始主混合液及样品接种
铝制密封膜	BioRad	359-0133	用于密封样品板
液滴生成仪	BioRad	186-3002
液滴生成油	BioRad	186-3005
芯片	BioRad	186-4008
DG8芯片支架	BioRad	186-3051
垫圈	BioRad	186-3009
20 µL 吸头	Rainin	GP-L10F	用于将样品/主混合液转移至芯片
200 µL 吸头	Rainin	GP-L200F	用于将液滴转移至最终的Twin.Tec板
Twin.Tec 96孔板	Eppendorf	951020320	用于最终液滴的热循环及读数
可穿刺热封箔	BioRad	181-4040	在热循环前密封Twin.Tec板
PX1 PCR板封膜仪	BioRad	181-4000	仅需热循环仪，无需光学检测
CFX96热循环仪	BioRad	CFX96 and C1000
QX100液滴读取仪	BioRad	186-3001
液滴读取油	BioRad	186-3004
液滴PCR预混液	BioRad	186-3024	即手稿中所述的数字PCR混合液
QuantaSoft软件（v1.3.2）	Quantasoft	QX100	用于查看、分析和导出ddPCR数据
肠球菌正向引物（Ent F1A）	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	可使用其他供应商
肠球菌反向引物（Ent R1）	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	可使用其他供应商
肠球菌探针（GPL813TQ）	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	可使用其他供应商，但荧光基团必须为FAM
HF183正向引物（HF183-1）	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	可使用其他供应商
HF183反向引物（BthetR1）	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	可使用其他供应商
HF183探针（BthetP1）	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	可使用其他供应商，但荧光基团必须为HEX（若使用VIC，则需选择适当的矩阵补偿）
阳性对照			由粪肠球菌基因组DNA与HF183标准质粒（从IDT订购）混合而成。有关粪肠球菌培养的详细方法E. faecalis及订购的HF183质粒序列，请参见Cao et al. 2015（doi:10.1016/j.watres.2014.12.008）。商业化的肠球菌DNA标准品（ATCC 29212Q-FZ）也可用于阳性对照，以替代实验室制备的E. faecalis基因组DNA。