实时定量反转录聚合酶链式反应诊断病毒感染

摘要

来源：Marston, D. A. 等。泛丽沙病毒实时逆转录聚合酶链式反应用于狂犬病诊断。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种利用实时逆转录PCR定量检测病毒感染的方法。逆转录步骤将RNA转化为cDNA，随后通过PCR循环进行扩增。通过分析PCR获得的DNA的扩增曲线和解离曲线，可确认样本中是否存在病毒RNA。

方案

1. 使用微量分光光度计定量RNA

1. 将分光光度计的设置调整为RNA模式。
2. 使用1-2 µL的分子级水初始化仪器并设定基线。
3. 使用1-2 µL的每种待测RNA样品评估RNA含量。
4. 保存读数并进行记录。
5. 如有需要，将RNA浓度调整至1 µg/µL。
   注意： RNA必须始终置于冰上（或低温块中）。若RNA是通过柱式或磁珠法提取的，其浓度通常低于1 µg/µL，此时应直接使用未经稀释的RNA样品。

2. 准备RNA稀释系列以确定终点灵敏度

1. 对RNA进行10倍系列稀释。
   1. 用稀释梯度（例如，10^-1、10^-2等）和RNA信息标记各离心管。
   2. 向每根离心管中加入45 µL分子生物学级水。
   3. 加入5 µL RNA（先前已稀释至1 µg/µL），充分混匀。
   4. 将移液枪吸头丢弃至适当的消毒液中，并更换新的吸头。
   5. 从10^-1 中取5 µL加入10^-2 管中，充分混匀。
   6. 对剩余的稀释梯度重复步骤2.1.3–2.1.5。
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结果

表1：泛丽沙病毒实时逆转录PCR主混合试剂。

试剂	每反应体积（μL）
分子级水	7.55
2x Universal RT PCR 反应混合液	10
正向引物 [20 μM]	0.6
反向引物 [20 μM]	0.6
RT 酶混合液	0.25
每反应总体积	19<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Art Barrier 吸头（多种规格）	Thermofisher	多种
离心机	Beckman	Allegra 21R	需配备可容纳 96 孔板的转子。见步骤 3.8。
微量离心机	Sigma
Finnpipette 移液器（用于分配 0.5–1000 µL）	Thermofisher	多种
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR 试剂盒	Bio-Rad	172-5150	若经过验证，可使用等效试剂盒
MX3000P 或 MX3005P 实时 PCR 系统	Stratagene	N/A	若经过验证，可使用等效仪器
MicroAmp 反应板底座	任何合适品牌		用于牢固固定管条和板。
光学透明平顶密封条（8联管）	ABgene	AB-0866
完美匹配框架（若使用管条）	Stratagene	N/A	与仪器型号匹配
引物：引物详细信息见表 2。			订购规格为 0.05 µmole，HPLC 纯化。
Thermo-Fast 96 孔板，无裙边	ABgene	AB-600
Thermo-Fast 密封条（8联管）Thermo-tubes	ABgene	AB-0452
涡旋振荡器 / Whirlimixer	Fisons Scientific equipment	SGP-202-010J
除非特别说明，可使用替代设备