野生型阻断PCR检测低频体细胞突变

摘要

来源：Albitar, A. Z. 等，野生型阻断PCR联合直接测序作为检测低频体细胞突变的高灵敏度方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了野生型阻断聚合酶链式反应（WTB-PCR），该技术用于检测体细胞突变。这种基于PCR的技术使用锁核酸（LNA），即一种寡核苷酸，可与其互补的野生型等位基因结合并阻断其延伸。该阻断作用可选择性地促进样本中低丰度突变等位基因相对于其野生型变体的扩增。

方案

1. 从福尔马林固定石蜡包埋组织、外周血和骨髓穿刺液中提取DNA

对于骨髓FFPE组织使用DNA FFPE提取试剂盒
1. 从未经染色的切片开始（5–10张，厚度为5–10 µm）。
  注意：若起始材料为组织碎屑，则使用3–6张厚度为5–10 µm的切片，并直接跳至步骤1.1.6。
2. 将切片放入切片架中，并准备四个洗涤槽（两个用于二甲苯，两个用于100%乙醇）。每个槽中加入至少600 mL溶液。
3. 在第一个槽中用二甲苯洗涤5分钟以脱蜡。将切片转移至第二个二甲苯洗涤槽中再洗涤5分钟。
4. 脱蜡后，用100%乙醇洗涤切片5分钟。再将切片转移至第二个乙醇洗涤槽中继续洗涤5分钟。
5. 在用刀片将组织刮入微量离心管前，需在通风橱中彻底干燥切片。
  注意：如有标注肿瘤区域的H&E染色切片，应与待处理切片对齐，并仅刮取肿瘤区域。
6. 按照试剂盒中所附制造商说明书中的指示继续操作。
对于骨髓穿刺液和外周血
1. 根据试剂盒说明书中的以下具体参数进行提取。
  注意：目前市面上有多种可用于FFPE组织和细胞DNA提取的商业试剂盒和方法。实际上，大多数均可使用。请选择实验室已建立的方法。
  1. 使用200 µL外周血（PB）或100 µL骨髓液（BM）加100 µL PBS。
  2. 使用4 µL RNase A储存液。
  3. 用100 µL洗脱缓冲液进行洗脱。
DNA定量
1. 使用分光光度计测定DNA浓度，确保260 nm/280 nm吸光度比值约为1.8（纯DNA的标准值）。若该比值明显偏低，可能提示存在蛋白质、苯酚或其他可能干扰后续实验的污染物。
2. 用适当的洗脱缓冲液将DNA浓度调整至约50–100 ng/µL。

2. 野生型阻断PCR

引物设计
1. 根据已报道的PCR引物设计通用指南，针对目的基因设计并获取引物。在PCR引物中包含M13正向和反向通用测序引物。
  注意： MYD88检测旨在扩增MYD88的第5外显子（G259 - N291）以及位于5'内含子区域的110个核苷酸，以覆盖剪接位点及第4内含子的部分区域。正向和反向引物均设计为在5'端添加M13序列（M13-正向：tgt aaa acg acg gcc agt；M13-反向：cag gaa aca gct atg acc），以便互补测序引物能够退火（参见材料表）。
锁核酸寡核苷酸设计
1. 设计阻断寡核苷酸，长度约为10 - 15个碱基，并与希望实现突变富集的野生型（WT）模板互补。
  注意： 较短的寡核苷酸可提高错配识别能力。为实现高靶标特异性，应避免使用过多的阻断核苷酸，否则可能导致寡核苷酸“粘性”过高。阻断核苷酸的组成、长度应根据需要阻断的具体核苷酸进行优化。必须在不破坏二级结构、避免自互补风险的前提下，实现高结合特异性。
2. 设计阻断寡核苷酸，使其T_m比热循环过程中的延伸温度高10 - 15 °C。通过增加或减少阻断碱基，或用DNA碱基替换部分阻断碱基来调节T_m，同时避免出现较长的（3 - 4个碱基）G或C阻断碱基连续序列。
  1. 访问Oligo工具网站（见材料表），选择“阻断寡核苷酸T_m预测”工具。
  2. 将希望被阻断的野生型模板序列粘贴至“Oligo Sequence”输入框中。在需作为阻断位点的碱基前添加“+”号。
  3. 点击“Calculate”按钮，以确定DNA-阻断剂杂交体的近似T_m。
3. 设计阻断寡核苷酸时，应避免形成二级结构或自二聚体。
  1. 访问Oligo工具网站（见材料表），选择“阻断寡核苷酸优化器”工具。
  2. 将希望被阻断的野生型模板序列粘贴至输入框中。在作为阻断位点的碱基前添加“+”号。
  3. 选中“Secondary Structure”和“Self Only”两个选项，点击“Analyze”按钮，以评估寡核苷酸是否存在潜在问题的二级结构或自二聚体。
    注意： 所显示的分数是对二级结构和自二聚体T_m的粗略估计，分数越低越理想，可通过限制阻断剂之间的配对来实现。MYD88的阻断寡核苷酸[MYD88 blocker (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)]设计用于覆盖氨基酸Q262-I266区域，其3'端带有反向dT，以抑制DNA聚合酶延伸和3'-外切核酸酶降解。该特定阻断寡核苷酸为17聚体，包含10个阻断碱基（标记为“+N”），其余7个为普通DNA核苷酸。
WTB-PCR设置与热循环
1. 制备WTB-PCR主混合液（MMX），每反应体系包含：2.5 µL 10x PCR反应缓冲液（含20 mM MgCl₂）、250 µM dNTPs、0.2 µM 正向和反向引物、1.2 µM MYD88阻断剂，以及DNA酶和RNA酶-free的超纯H₂O，最终反应体积为21.75 µL/反应。
  注意： 所列浓度为最终25 µL反应体积（加入DNA模板和聚合酶后）的工作浓度。常规PCR主混合液只需省略阻断剂即可制备。WTB-PCR与常规PCR的所有操作步骤完全相同，可用于验证并评估加入阻断剂后实现的富集效果。
  1. 计算所需MMX体积时，应额外预留3个反应（阳性对照、阴性对照和无模板对照以检测污染）以及至少1个反应以补偿移液误差。
2. 充分涡旋混匀MMX。MMX可在-80 °C保存长达一年。
3. 每反应加入0.25 µL Taq DNA聚合酶至MMX中，轻柔翻转混匀。一旦加入聚合酶，MMX应始终置于冰上。
4. 将新的96孔PCR板置于冷板上，每孔加入22 µL含聚合酶的MMX。
5. 向每孔含MMX和聚合酶的反应体系中加入3 µL基因组DNA（50 - 100 ng/µL）。
6. 密封PCR板并短暂离心，确保溶液沉降至各孔底部。
7. 将PCR板放入热循环仪中。
  1. 设置WTB-PCR热循环条件如下：95 °C预变性6分钟；随后进行40个循环，每个循环包括：95 °C变性30秒，56 °C引物退火30秒，72 °C延伸1分20秒；最后72 °C终延伸10分钟。
    注意： 最佳操作规范建议在物理隔离的区域完成后续所有步骤，以防止扩增子对后续实验造成污染。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1.5 或 2 mL 安全锁扣微型离心管	Eppendorf	05-402-25
100% 乙醇	VWR	89370-084	组织学级别；含 91.5% 乙醇、5% 异丙醇、4.5% 甲醇
铝制封口箔	GeneMate	T-2451-1	用于 PCR 及低温储存
Centrifuge 5804 系列离心机	Eppendorf		配备 A-2-DWP 转子（适用于 PCR 板）
96 孔板用冷板	Eppendorf	Z606634
无 DNA 酶、无 RNA 酶的超纯水
dNTPs（100 mM）	Invitrogen	10297-117
绝对乙醇	Sigma	E7023	200 proof，适用于分子生物学
Exiqon 网站 Oligo Tools 工具			http://www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）	Roche	12032937001	含 10 倍浓缩 PCR 反应缓冲液，含 20 mM MgCl₂
凝胶电泳装置			2% 琼脂糖凝胶
LNA 寡核苷酸	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A +T+CC/invdT/（+N = LNA 碱基）
Mastercycler Pro S 梯度 PCR 仪	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430 微型离心机	Eppendorf		配备 FA-45-30-11 转子（适用于 1.5/2 mL 微型离心管）
NanoDrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific
PCR 正向引物	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR 反向引物	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR 板	GeneMate	T-3107-1
移液器			20、200、1,000 µL
QIAamp DNA Mini 试剂盒	Qiagen	51304	适用于骨髓穿刺液和外周血
Vortex genie 涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236
载玻片篮

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