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1. 从 FFPE 组织、外周血和骨髓穿刺物中提取 DNA
- 用于骨髓 FFPE 组织，使用 DNA FFPE 提取试剂盒
- 从未染色载玻片的 FFPE 组织开始（5 - 10 个切片，厚度为 5 - 10 μm）
注意:如果从组织屑开始，使用 3 - 6 个 5 - 10 μm 厚度的切片，然后跳至步骤 1.1.6。
- 将载玻片放入载玻片篮中并准备四个洗涤储液槽（两个用于二甲苯，两个用于 100% 酒精）。向每个篮子中加入最小体积为 600 mL 的溶液。
- 通过在第一个托盘中进行 5 分钟的二甲苯洗涤来脱蜡玻片。将玻片转移到第二个二甲苯洗涤储液槽中再放置 5 分钟。
- 脱蜡后，用 100% 酒精洗涤载玻片 5 分钟。将载玻片转移到第二个酒精洗涤储液槽中再 5 分钟。
- 让载玻片在通风橱下完全干燥，然后用剃须刀片将其刮入微量离心管中。
注意:如果有带有指示肿瘤区域的 H&E 载玻片可用，请对齐载玻片并仅刮擦肿瘤区域。
- 按照套件中包含的制造商讲义中的说明进行作。
- 用于 BM 抽吸物和外周血
- 根据制造商的说明提取这些规格的讲义。
注意:有许多市售的试剂盒和方法可用于从 FFPE 组织和细胞中提取 DNA。实际上，都可以使用。使用实验室中建立的方法。
- 使用 200 μL 外周血 （PB） 或 100 μL BM + 100 μL PBS。
- 使用 4 μL RNase A 储备液。
- 用 100 μL 洗脱缓冲液洗脱。
- DNA 定量
- 使用分光光度计测量 DNA 浓度，确保 260 nm/280 nm 比率约为 1.8（对于纯 DNA）。如果该比率明显较低，则可能表明存在蛋白质、苯酚或其他可能干扰下游应用的污染物。
- 使用适当的洗脱缓冲液将 DNA 浓度调整至约 50 - 100 ng/μL。
2. 野生型封闭 PCR
- 引物设计
- 根据先前描述的 PCR 引物设计的一般指南设计和获得目标基因的引物。在 PCR 引物中包括 M13 正向和反向通用测序引物。
注意:MYD88 检测用于扩增 MYD88 （G259 - N291） 的外显子 5 和位于 5' 内含子区的 110 个核苷酸，以覆盖剪接位点和内含子 4 的一部分。正向和反向引物设计有 5'-M13 序列 （M13- 正向:tgt aaa acg acg gcc agt;M13 反向:cag gaa aca gct atg acc），以允许互补测序引物退火（参见材料表）。
- 锁定核酸寡核苷酸设计
- 将封闭寡核苷酸设计为长度约为 10 - 15 个碱基，并与需要突变体富集的 WT 模板互补><。
注意:较短的寡核苷酸将改善错配鉴别。为了获得高靶标特异性，重要的是不要使用过多的封闭核苷酸，因为这会导致非常"粘稠"的寡核苷酸。应根据需要封闭的特定核苷酸优化其含量和长度以及封闭核苷酸。重要的是在不影响二级结构和冒着自我互补风险的情况下实现高结合特异性。
- 在热循环过程中，将封闭寡核苷酸的 Tm 设计为比延伸温度高 10 - 15 °C。通过添加或删除封闭碱基或用封闭碱基代替 DNA 来调整 Tm，同时避免长时间（3 - 4 个碱基）封闭 G 或 C 碱基。
- 导航到 Oligo 工具网站（参见材料表）并选择"封闭 Oligo Tm 预测"工具。
- 将需要封闭的 WT 模板序列粘贴到"Oligo Sequence"框中。在基地前添加 "+" 以表示阻挡者基地。
- 选择 "Calculate" 按钮以确定 DNA-Blocker 杂交体的近似 Tm。
- 设计封闭寡核苷酸以避免二级结构形成或自二聚体。
- 导航至 Oligo 工具网站（参见材料表）并选择"封闭 Oligo Optimizer"工具。
- 将要阻止的 WT 模板的序列粘贴到框中。在基地前添加 "+" 以表示阻止基地。
- 选中 "Secondary Structure" 和 "Self Only" 两个框。按下 Analyze（分析）按钮，查看寡核苷酸中可能存在麻烦的二级结构或自二聚体。
注意:这些分数代表了对二级结构和自二聚体的 Tm 的非常粗略的估计。因此，较低的分数是最佳的，可以通过限制阻滞剂-阻滞剂配对来实现。MYD88 的封闭寡核苷酸 [MYD88 阻断剂 （TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/）] 被设计为覆盖氨基酸 Q262-I266，并具有 3'-反向 dT 以抑制 DNA 聚合酶的延伸和 3'-核酸外切酶的降解。这种特异性封闭寡核苷酸是一种 17 聚体，具有 10 个封闭碱基，用"+N"表示。其余 7 个碱基是普通 DNA 核苷酸。
- WTB-PCR 构建和热循环
- 使用 2.5 μL PCR 反应缓冲液 10x w/ 20 mM MgCl2、250 μM dNTP、0.2 μM 正向和反向引物、1.2 μM MYD88 阻断剂和 DNAse（不含 RNAse）超纯 H2O 制备 WTB-PCR 预混液 （MMX），每个反应的最终溶液体积为 21.75 μL><。
注意:工作浓度适用于 25 μL 的最终反应体积（加入 DNA 模板和聚合酶后）。常规 PCR MMX 的制备方法只需省略添加封闭剂即可。WTB 和常规 PCR 的所有方案步骤均相同。这可用于验证和确定通过添加阻滞剂实现的富集。
- 在计算要制备的 MMX 量时，请确保考虑 3 个额外的反应（阳性和阴性对照以及一个非模板对照，以检查污染）和至少 1 个额外的移液错误反应。
- 彻底涡旋 MMX。MMX 可在 -80 °C 下储存长达一年。
- 每个反应向 MMX 中加入 0.25 μL Taq DNA 聚合酶，并倒置混合。将聚合酶添加到 MMX 中后，将其保存在冰上。
- 将新的 96 孔 PCR 板放在冷板上，将 22 μL 带有聚合酶的 MMX 移液到每个反应孔中。
- 向含有聚合酶的 MMX 的每个孔中加入 3 μL 基因组 DNA （50 - 100 ng/μL）。
- 密封板并短暂离心，以确保溶液到达每个孔的底部。
- 将 PCR 板加载到热循环仪上。
- 将WTB-PCR反应的热循环条件设置为如下:在95°C下初始变性6分钟;在95°C下变性40次循环30秒，引物在56°C下退火30秒，并在72°C下延伸1分钟20秒;最终在72°C下延伸10分钟
注意:最佳实践包括在物理上独立的区域完成方案的其余部分，以避免在未来设置中受到扩增子污染。