定量聚合酶链式反应法检测噬菌体数量

摘要

来源：Peng, X., 等，生物筛选中T7噬菌体的定量PCR。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们介绍通过DNA定量来计数T7噬菌体的定量聚合酶链式反应（qPCR）。PCR反应体系中的荧光染料与新合成的DNA链结合并发出荧光，荧光信号被检测并量化。

方案

1. 准备 qPCR 反应

注意：一次 PCR 反应对应一个样本。每次 PCR 反应包含 5 µL qPCR 预混液（参见材料）、1 µL 5 µM 引物对混合液、2 µL H₂O 和 2 µL 经热处理的 T7 噬菌体样本。对于多个 PCR 反应，除噬菌体样本外的所有试剂在 1.5 mL 离心管中预先混合。预混液中每种试剂的体积取决于用于 qPCR 的噬菌体样本数量。

1. 为10个未知浓度的噬菌体生物淘选样品和7个已知标准浓度的样品（每个样品设三个重复）配制qPCR预混液。总计需要处理51个样品，即进行51次qPCR反应（即每个样品对应一次反应）。针对51次反应，准备255 µL qPCR预混主液（51 × 5 µL）、51 µL引物（51 × 1 µL）以及102 µL H₂O（51 × 2 µL）。
   注意：建议额外多配制几份PCR反应体系，以补偿分装过程中可能造成的液体损耗。
2. 将8 µL PCR预混液分装至96孔qPCR板的每个孔中，共分装51个孔（即51次qPCR反应）。分装过程中无需更换吸头。
3. 向各孔中加入2 µL热处理后的T7噬菌体样品或T7噬菌体参考DNA（图1B）；在向不同孔中添加不同DNA样品时必须更换吸头，以防交叉污染。同时，应将2 µL DNA样品加至qPCR预混液液面以下（即加入8 µL PCR预混液中）。
4. 使用粘性封板膜密封qPCR板。
   注意：此步骤至关重要，无论使用何种类型的qPCR板。必须使用推荐的试剂盒将板完全密封；否则，任何未密封区域都可能导致PCR扩增过程中液体蒸发损失。
5. 用铝箔纸包裹qPCR板，以最大限度减少荧光淬灭，随后将其放入qPCR仪器中运行程序。

2. qPCR 循环条件

注意：qPCR 扩增条件根据特定的 qPCR 仪器设备进行设置。

1. 将 96 孔 qPCR 板放入 qPCR 仪器中运行。在仪器上，从菜单中选择设置，以配置以下实验条件（图 1C）。
2. 针对 10 µL 的样品体积，设置如下循环条件：50°C 保持 2 分钟，1 个循环；95°C 保持 2 分钟，1 个循环；随后进行 40 个循环的扩增（95°C 15 秒，60°C 1 分钟）。之后运行熔解曲线程序：95°C 15 秒，60°C 1 分钟，再 95°C 15 秒，各 1 个循环。
3. 继续进行数据分析。

结果

图1：噬菌体样品处理、qPCR反应制备及qPCR运行。 经DNase I预处理的T7噬菌体样品在100°C加热15分钟，以从完整的噬菌体颗粒中释放T7 DNA（A）；qPCR反应体系的制备按照本方案所述进行。所有操作均在冰上完成（A）；使用qPCR仪器及配套软件（B）设置扩增程序，运行PCR循环，并获取和分析原始数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T7 噬菌体基因组 DNA 引物	IDT		F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select 包装对照 DNA	EMD Millipore	69679-1UG
MicroAmp 光学 96 孔反应板	ThermoFisher Scientific	N8010560
qPCR 预混液 - Power Up SYBR Green 预混液	Applied Biosystems	Applied Biosystems
MicroAmp 光学封口膜试剂盒	ThermoFisher Scientific	ThermoFisher Scientific
UltraPure 去 DNase/RNase 蒸馏 H<sub>2</sub>O	Invitrogen	10977015
ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统（配备快速 96 孔模块）	ThermoFisher Scientific	4453535
QuantStudio 实时荧光定量 PCR 软件	ThermoFisher Scientific		v1.2