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定量聚合酶链式反应法检测噬菌体数量

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:Peng, X., 生物筛选中T7噬菌体的定量PCRJ. Vis. Exp. (2018)

在本视频中,我们介绍通过DNA定量来计数T7噬菌体的定量聚合酶链式反应(qPCR)。PCR反应体系中的荧光染料与新合成的DNA链结合并发出荧光,荧光信号被检测并量化。

方案

1. 准备 qPCR 反应

注意:一次 PCR 反应对应一个样本。每次 PCR 反应包含 5 µL qPCR 预混液(参见材料)、1 µL 5 µM 引物对混合液、2 µL H2O 和 2 µL 经热处理的 T7 噬菌体样本。对于多个 PCR 反应,除噬菌体样本外的所有试剂在 1.5 mL 离心管中预先混合。预混液中每种试剂的体积取决于用于 qPCR 的噬菌体样本数量。

  1. 为10个未知浓度的噬菌体生物淘选样品和7个已知标准浓度的样品(每个样品设三个重复)配制qPCR预混液。总计需要处理51个样品,即进行51次qPCR反应(每个样品对应一次反应)。针对51次反应,准备255 µL qPCR预混主液(51 × 5 µL)、51 µL引物(51 × 1 µL)以及102 µL H2O(51 × 2 µL)。
    注意:建议额外多配制几份PCR反应体系,以补偿分装过程中可能造成的液体损耗。
  2. 将8 µL PCR预混液分装至96孔qPCR板的每个孔中,共分装51个孔(51次qPCR反应)。分装过程中无需更换吸头。
  3. 向各孔中加入2 µL热处理后的T7噬菌体样品或T7噬菌体参考DNA(图1B);在向不同孔中添加不同DNA样品时必须更换吸头....

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结果

配备热循环仪、冰盒和PCR仪的实验室装置;DNA扩增过程。
图1:噬菌体样品处理、qPCR反应制备及qPCR运行。 经DNase I预处理的T7噬菌体样品在100°C加热15分钟,以从完整的噬菌体颗粒中释放T7 DNA(A);qPCR反应体系的制备按照本方案所述进行。所有操作均在冰上完成(A);使用qPCR仪器及配套软件(B)设置扩增程序,运行PCR循环,并获取和分析原始数据。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
T7 噬菌体基因组 DNA 引物IDTF: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select 包装对照 DNAEMD Millipore69679-1UG
MicroAmp 光学 96 孔反应板ThermoFisher ScientificN8010560
qPCR 预混液 - Power Up SYBR Green 预混液Applied BiosystemsApplied Biosystems
MicroAmp 光学封口膜试剂盒ThermoFisher ScientificThermoFisher Scientific
UltraPure 去 DNase/RNase 蒸馏 H<sub>2</sub>OInvitrogen10977015
ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统(配备快速 96 孔模块)ThermoFisher Scientific4453535
QuantStudio 实时荧光定量 PCR 软件ThermoFisher Scientificv1.2

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标签

T7 qPCR DNA Ct qPCR

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