来源：Lee, S. H. 等，一种基于液滴的微流控方法及微球-PCR扩增用于单链DNA扩增子。 J. Vis. Exp. (2018)。
本视频介绍了在单管反应中利用寡核苷酸包被的聚合物微球扩增单链DNA的技术。该过程可获得高纯度的单链DNA，可用于后续的DNA测序和微阵列分析。
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方法文章
微球聚合酶链式反应扩增单链DNA
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 用于扩增单链DNA的不对称PCR
- 准备用于扩增待分析单链DNA（ssDNA）的不对称PCR试剂混合物。将 表1 中的试剂在冰上解冻。Taq DNA聚合酶（50 U/µL）不得置于冰上，应于20 °C保存直至使用。
- 轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。
- 按照 表1 所述组合所有试剂。
- 将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR：25个循环（95 °C 30秒，52 °C 30秒，72 °C 30秒），85 °C 5分钟，4 °C 保存。
2. 用于扩增单链DNA的微球PCR
注意：本节描述了在 PCR 反应管中扩增单链 DNA（ssDNA）的实验方案。微球-PCR 反应体系总体积为 50 μL。用于扩增 ssDNA 的详细序列见表 2。在此过程中，微球表面的 Ap 可以以互补方式与随机 DNA 模板退火。这是生成互补 DNA 链（反义 DNA 链，图 1）的关键步骤。延伸所得的 DNA 将作为微球-PCR 扩增的模板。
- 配制微球-PCR试剂混合液。将表3中的试剂在冰上解冻；但Taq DNA聚合酶无需置于冰上，应保存在-20 °C，待使用时取出。
- 轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。
- 通过显微镜计数获取约~25个微球。
注意：单个反应管中微球的数量通过40倍光学显微镜进行计算。微球-PCR扩增使用约~25个微球。更详细信息见步骤3。 - 按照表3中所述组合所有试剂。
- 将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR：25个循环（95 °C变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），85 °C延伸5分钟，4 °C保存。
- 扩增完成后，向每个样品中加入8 μL 6×上样缓冲液，取15 μL样品加入2%琼脂糖凝胶中。随后在1× TAE（Tris-乙酸-EDTA，40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.2）缓冲液中以100 V电泳35分钟。
表1. 20 μL反应体系中不对称PCR试剂混合物的组分。
| 试剂 | 单次反应所需体积（μL） | 终浓度 |
| 随机DNA模板 | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-上游引物 | 1 | 0.4 μM |
| 下游引物 | 1 | 0.02 μM |
| 10X Taq缓冲液 | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq（1000U） | 0.2 | 1 U |
| 水 | 37.8 | - |
| 总量 | 50 | - |
表2. 微球PCR的序列信息。
| 模板 | 序列 | 长度 (nt) |
| 随机DNA模板 | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (随机序列，40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| 标签-正向引物 (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| 反向引物 | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
表3. 50 μL反应体系中微球-PCR试剂混合物的组分
| 试剂 | 单次反应所需体积 (μL) | 终浓度 |
| Ap-Microspheres | 约25个微球 | - |
| 随机DNA模板 | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward引物 | 1 | 0.4 μM |
| 10X Taq缓冲液 | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| 水 | 37.8 | - |
| 总量 | 50 | - |
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结果
图1：微球PCR实验流程示意图。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40% 丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液 (19:1) | Bio-rad | 1610140 | 共聚可交联寡核苷酸微球的组分 |
| 过硫酸铵，APS | Sigma Aldrich | A3678 | 丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液的硬化剂 |
| N,N,N′,N′-四甲基乙二胺，TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | 过硫酸铵的催化剂 |
| 矿物油 | Sigma Aldrich | M5904 | 表1. 溶液III. 微球试剂组分 |
| 丙烯酰胺标记的单链DNA探针 | Bioneer | 合成 | 表1. 溶液I. 微球试剂组分 |
| Tris | Biosesang | T1016 | TE缓冲液组分，pH缓冲溶液 |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | TE缓冲液组分，去除离子（Ca²⁺） |
| Ex Taq | Takara | RR001A | 单链DNA扩增 |
| T100 梯度PCR仪 | Bio-rad | 1861096 | 单链DNA扩增 |
