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1. 用于扩增单链DNA的不对称PCR
- 准备用于扩增待分析单链DNA（ssDNA）的不对称PCR试剂混合物。将 表1 中的试剂在冰上解冻。Taq DNA聚合酶（50 U/µL）不得置于冰上，应于20 °C保存直至使用。
- 轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。
- 按照 表1 所述组合所有试剂。
- 将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR：25个循环（95 °C 30秒，52 °C 30秒，72 °C 30秒），85 °C 5分钟，4 °C 保存。
2. 用于扩增单链DNA的微球PCR
注意：本节描述了在 PCR 反应管中扩增单链 DNA（ssDNA）的实验方案。微球-PCR 反应体系总体积为 50 μL。用于扩增 ssDNA 的详细序列见表 2。在此过程中，微球表面的 Ap 可以以互补方式与随机 DNA 模板退火。这是生成互补 DNA 链（反义 DNA 链，图 1）的关键步骤。延伸所得的 DNA 将作为微球-PCR 扩增的模板。
- 配制微球-PCR试剂混合液。将表3中的试剂在冰上解冻；但Taq DNA聚合酶无需置于冰上，应保存在-20 °C，待使用时取出。
- 轻轻涡旋混匀所有试剂，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。
- 通过显微镜计数获取约~25个微球。
注意：单个反应管中微球的数量通过40倍光学显微镜进行计算。微球-PCR扩增使用约~25个微球。更详细信息见步骤3。
- 按照表3中所述组合所有试剂。
- 将样品放入热循环仪中，并按以下条件启动不对称PCR：25个循环（95 °C变性30秒，52 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），85 °C延伸5分钟，4 °C保存。
- 扩增完成后，向每个样品中加入8 μL 6×上样缓冲液，取15 μL样品加入2%琼脂糖凝胶中。随后在1× TAE（Tris-乙酸-EDTA，40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.2）缓冲液中以100 V电泳35分钟。
表1. 20 μL反应体系中不对称PCR试剂混合物的组分。
| 试剂 | 单次反应所需体积（μL） | 终浓度 |
| 随机DNA模板 | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-上游引物 | 1 | 0.4 μM |
| 下游引物 | 1 | 0.02 μM |
| 10X Taq缓冲液 | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq（1000U） | 0.2 | 1 U |
| 水 | 37.8 | - |
| 总量 | 50 | - |
表2. 微球PCR的序列信息。
| 模板 | 序列 | 长度 (nt) |
| 随机DNA模板 | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (随机序列，40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| 标签-正向引物 (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| 反向引物 | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
表3. 50 μL反应体系中微球-PCR试剂混合物的组分
| 试剂 | 单次反应所需体积 (μL) | 终浓度 |
| Ap-Microspheres | 约25个微球 | - |
| 随机DNA模板 | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward引物 | 1 | 0.4 μM |
| 10X Taq缓冲液 | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| 水 | 37.8 | - |
| 总量 | 50 | - |
