$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 病毒 RNA 的逆转录
- 从冰箱中取出表 1 中列出的 RT 试剂，放在冰上，并在使用前解冻和涡旋。
- 使用 表 1 中列出的试剂在 0.2 mL PCR 管中制备 12 μL RT 反应混合物。通过制备至少比所需反应量大一个反应体积的预混液来允许移液变化。
- 在模板室的 PCR 工作站内，将 8 μL 样品、阳性对照 RNA 或阴性对照添加到 RT 反应混合物中。RT 阳性对照是从感染固定 RABV 菌株 CVS-11（攻击病毒标准品 11）的细胞培养物中提取的 RNA，并储存在 -80°C 下。阴性对照含有不含 RNase 的 ddH2O。
- 通过顶点混合 RT 管的内容物;然后，短暂离心。
- 将反应管加载到热循环仪中。在以下条件下设置 cDNA 合成程序:42°C 90 分钟，95°C 5 分钟，4°C 保持。将反应体积设置为 20 μL。开始 RT 运行。
2. 第一轮 PCR
- 将表 2 中列出的 PCR 试剂保存在洁净室的冰上直至使用;然后，解冻并涡旋它们。
- 使用 表 2 中列出的试剂在 0.2 mL PCR 管中制备第一轮 PCR 混合物。
- 在模板室的 PCR 工作站内，将 2 μL cDNA 或质粒样品添加到第一轮 PCR 混合物中。PCR 阳性对照是上述 RT 方法的步骤 1.3 中所述制备的 CVS-11 cDNA。PCR 阴性对照为 dd H2O。
- 将密封管转移到 PCR 热循环仪中，并使用表 3 中列出的参数进行循环。
3. 第二轮 PCR
- 使用表 4 中列出的试剂在 0.2 mL PCR 管中制备第二轮 PCR 混合物。
- 将 2 μL 第一轮 PCR 产物添加到第二轮 PCR 混合物中。此外，包括 dd H2O 作为第二轮 PCR 的阴性对照。
- 使用与步骤 2.4 中给出的相同参数进行 PCR 热循环。
表 1:用于 cDNA 合成的逆转录试剂。
<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
元件
每次反应体积 （μl）
dNTPs（2.5 mM）
4
随机引物 （50 μM）
1,5
寡核苷酸 （dT） 15 （50 μM）
0,5%
M-MLV 缓冲液 （5x）
4
M-MLV 逆转录酶 （200 IU/μL）
1
RNasin （40 国际单位/μL）
1
总体积
12
表 2:第一轮 PCR 的试剂。
<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
元件
每次反应体积 （μl）
dNTP （10 毫米）
1
Ex-Taq （5 U/μL）
0,3
Taq 缓冲液 （10x）
5
N127 （20 微米）
1
N829 （20 微米）
1
dd H
2O
39,7%
总体积
48
表 3:第一轮和第二轮 PCR 的循环参数
<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
温度
时间
周期
94 摄氏度
2 分钟
1
94 摄氏度
30 秒
35
56 摄氏度
30 秒
35
72 摄氏度
40 秒
35
72 摄氏度
10 分钟
1
4 °C
∞
表 4:第二轮 PCR 的试剂。
<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
元件
每次反应体积 （μl）
dNTP （10 毫米）
1
Ex-Taq （5 U/μL）
0,3
Taq 缓冲液 （10x）
5
N371F （20 微米）
1
N371R （20 微米）
1
dd H
2O
39,7%
总体积
48