巢式PCR检测特定病毒基因组序列

摘要

来源：Feng, Y.，等。通用巢式逆转录聚合酶链式反应检测狂犬病毒属病毒的评价。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了巢式聚合酶链式反应，该技术采用两对引物进行两次连续的PCR扩增。第一对引物设计用于与第二对引物上游的序列结合，从而实现对特定基因序列的选择性扩增。该PCR方法比常规PCR具有更高的灵敏度和特异性，被广泛用作多种疾病的检测技术。

方案

1. 病毒RNA的反转录

1. 从冷冻柜中取出 表1 所列的反转录（RT）试剂，置于冰上，使用前充分解冻并涡旋混匀。
2. 在0.2 mL PCR管中，按照 表1 所列试剂配制12 µL反转录反应体系。为避免移液误差，配制的预混液体积应比实际所需反应数多至少一个反应量。
3. 在模板操作间内的PCR工作站中，向反转录反应体系中加入8 µL待测样本、阳性对照RNA或阴性对照。反转录阳性对照为从感染固定毒株RABV CVS-11（challenge virus standard-11）的细胞培养物中提取的RNA，保存于-80°C；阴性对照为无RNase的ddH₂O。
4. 通过涡旋振荡混匀反转录反应管中的内容物，然后短暂离心。
5. 将反应管放入热循环仪中，设置cDNA合成程序如下：42°C反应90分钟，95°C变性5分钟，4°C保存。设定反应体积为20 µL，启动反转录程序。

2. 第一轮PCR

1. 将 表2 中列出的PCR试剂在洁净室中保持冰上放置直至使用；然后将其解冻并涡旋混匀。
2. 在0.2 mL PCR管中，使用 表2 中列出的试剂配制第一轮PCR反应体系。
3. 在模板室的PCR工作站内，向第一轮PCR反应体系中加入2 µL cDNA或质粒样品。PCR阳性对照为上述RT方法中所述的CVS-11 cDNA（见步骤1.3）。PCR阴性对照为dd H₂O。
4. 将密封的PCR管转移至PCR扩增仪，按照 表3 中列出的程序进行扩增循环。

3. 第二轮 PCR

1. 使用 表4 中列出的试剂，在0.2 mL PCR管中配制第二轮PCR反应体系。
2. 向第二轮PCR反应体系中加入2 µL第一轮PCR产物。此外，以dd H₂O作为第二轮PCR的阴性对照。
3. 采用与步骤2.4相同的程序进行PCR扩增循环。

表1：cDNA合成的逆转录试剂。

组分	每反应体积 (µl)
dNTPs (2.5 mM )	4
随机引物 (50 μM)	1.5
Oligo(dT) 15 (50 μM)	0.5
M-MLV 缓冲液 (5x)	4
M-MLV 逆转录酶 (200 IU/µL)	1
RNasin (40 IU/µL)	1
总体积	12

表2：第一轮PCR的试剂。

组分	每反应体积 (µl)
dNTPs (10 mM)	1
Ex-Taq (5 U/μL)	0.3
Taq Buffer (10x)	5
N127 (20 μM)	1
N829 (20 μM)	1
dd H2O	39.7
总体积	48

表3：第一轮和第二轮PCR的循环参数

温度	时间	循环
94 °C	2 min	1
94 °C	30 s	35
56 °C	30 s	35
72 °C	40 s	35
72 °C	10 min	1
4 °C	∞

表4：第二轮PCR的试剂。

组分	每反应体积 (µl)
dNTPs (10 mM)	1
Ex-Taq (5 U/μL)	0.3
Taq Buffer (10x)	5
N371F (20 μM)	1
N371R (20 μM)	1
dd H2O	39.7
总体积	48

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ddH2O	多种	多种
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
微量离心管	多种	多种
M-MLV 逆转录酶 (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR仪	BIO-RAD	T100
PCR管	多种	多种
移液器	多种	多种
随机引物	TakaRa	3801
RNase抑制剂 (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
无RNase的ddH2O	TakaRa	9102
Taq缓冲液 (10x)	TakaRa	9152A
移液器吸头	多种	多种
涡旋混合器	多种	多种