高分辨率熔解PCR检测突变DNA序列中的序列变异

摘要

来源：Kisserli, A.，等. 高分辨率熔解PCR用于补体受体1长度多态性基因分型：阿尔茨海默病易感基因评估的创新工具。J. Vis. Exp. (2017)。

在本视频中，我们介绍一种高分辨率熔解曲线PCR技术，该技术基于熔解温度分析，用于确定不同序列长度的DNA片段的长度多态性。

方案

1. HRM-PCR 实验方案

1. 解冻DNA样品。将DNA样品加入1.5 mL离心管中，用水稀释，调整浓度至10 ng/µL。
   注意： 稀释后DNA的总体积应在2 µL至10 µL之间。
2. 解冻引物溶液。在1.5 mL离心管中用水稀释引物溶液，使其浓度均调整为6 µM。
   注意： 引物序列和反应条件见于 表1.
3. 解冻HRM-PCR试剂盒溶液，轻轻涡旋混匀，以确保充分回收所有组分。将含有酶混合物与DNA结合染料、MgCl₂的三个小瓶短暂离心。₂在打开微型离心管之前，先将其在微型离心机中离心，以去除管壁上的冷凝水。室温下保存。
4. 在室温下，于1.5 mL离心管中配制一份20 µL PCR反应体系，按以下顺序加入各组分：
   1. 含DNA结合染料的10 µL酶混合物；
   2. 2 µL 25 mM MgCl₂;
   3. 1 µL 引物1，6 µM（终浓度：300 nM）；
   4. 1 µL 引物2，6 µM（终浓度：300 nM）；以及
   5. 5 µL 水。
      注意： 为进行多个反应配制PCR混合液时，将上述各组分体积乘以拟进行的反应数，再额外增加一个反应的量。
5. 轻轻混匀，使用涡旋振荡器。
6. 将上述制备的 19 µL PCR 混合液加入白色多孔板的每个孔中。
7. 加入1 µL浓度调整后的DNA模板。
   注意： 对照反应中，每次均需随样本设置阴性对照。制备阴性对照时，以水替代模板DNA。
8. 用封板膜密封白色多孔板。
9. 将白色多孔板放入离心机中，并使用适当的配重进行平衡（即， 另一块多孔板）。在配备适用于多孔板转子及相应适配器的标准摆动桶离心机中，以1,500 × g离心1分钟。
10. 将白色多孔板装入HRM-PCR仪器中。
11. 启动HRM-PCR程序，PCR条件如下：
    变性：95 °C，10 分钟；1 个循环。
    扩增：95 °C 10 s，62 °C 15 s，72 °C 20 s；共47个循环。
    熔解曲线：95 °C；升温速率：0.02 °C/s；每°C采集25次数据；1个循环。
    冷却：40 °C 下 30 秒；升温速率为 2.2 °C/s；1 个循环。

表1：高分辨率熔解分析中使用的引物及参数。

2. 通过高分辨率熔解曲线分析确定CR1长度多态性

注意：所述方法（图1）专用于我们的软件（参见材料表），尽管也可使用其他软件包。

1. 打开基因扫描软件，进行CR1长度多态性扫描分析。
2. 打开包含扩增程序和熔解曲线程序的实验文件。
3. 在模块栏中点击Sample editor，然后选择Scanning 工作流程。
4. 定义样本属性（例如：名称；未知样本或阴性对照）。
5. 在Module 栏中点击Analysis 。
6. 在Create New Analysis列表中选择Gene Scanning.
7. 点击Normalization 选项卡，对熔解曲线进行归一化处理。
8. 点击Temperature shift 选项卡，重设熔解曲线的温度轴（x轴）。
   注意： 下方图表显示的是经过归一化和温度校正后的熔解曲线。
9. 点击Calculate 按钮，分析结果并确定分组情况。
10. 在图表区域点击Difference plot 选项卡，查看Normalized and Shifted Melting Curves 以及Normalized and Temperature Shifted Difference Plot.

结果

图1：本实验方案第2步所用软件图形界面的截图。(A) 打开基因扫描软件。(B) 扩增程序和熔解曲线程序。(C) 在Module工具栏中点击Sample editor。(D) 选择Scanning模式。(E) 定义样本的属性。(F) 在Module工具栏中点击Analysis。(G) 点击Normalization标签页，对熔解曲线...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验服			防护
SensiCareIce 无粉丁腈检查手套	Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA	486802	样品保护
Eppendorf Reference 2 移液器，0.5-10µL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000024	样品移液
Eppendorf Reference 2 移液器，20-100µL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000059	样品移液
Eppendorf Reference 2 移液器，100-1000µL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4920000083	样品移液
TipOne 10µL 刻度滤芯吸头	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany	S1121-3810	样品移液
TipOne 1-100µL 斜面滤芯吸头 	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany	S1120-1840	样品移液
ART 1000E 隔离吸头	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	2079E	样品移液
Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 mL，Eppendorf 品质	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	30120086	混匀
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器	Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA	SI-0236	混匀
Mikro 200 离心机	Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany	0002020-02-00	离心
Multipette E3 多通道移液器	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France	4987000010	分液
Light Cycler 480 96 孔白色多孔板	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany	4729692001	反应容器
Light Cycler 480 密封箔	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany	4429757001	覆盖
LightCycler 480 Instrument II，96 孔	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany	05015278001	高分辨率熔解曲线聚合酶链式反应
Heraeus Megafuge 11R 离心机	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France	75004412	离心
LightCycler 480 高分辨率熔解预混液	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany	04909631001	反应试剂
CN3 引物：5'ggccttagacttctcctgc 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgium		反应试剂
CN3re 引物：5'gttgacaaattggcggcttcg 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgium		反应试剂
Light Cycler 480 SW 1.5.1 软件	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany		用于 HRM-PCR CR1 多态性数据分析的软件