多重液滴聚合酶链式反应检测白细胞DNA甲基化

摘要

来源：Malic, L.，等。利用聚合物液滴发生器装置进行血液学诊断的甲基化特异性多重液滴PCR J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了多重液滴式聚合酶链式反应技术，用于同时定量不同白细胞群体中的甲基化DNA区域，作为临床诊断和预后的早期生物标志物。

方案

1. 液滴生成与PCR

注意： 表1 列出了用于C-LESS、CD3Z和Foxp3基因的正向与反向引物以及双淬灭水解探针的信息，这些是多重扩增去甲基化基因靶标所必需的。

1. 按照表2所述配制主混合液。
2. 除酶混合液外，将主混合液的所有组分解冻。通过上下吹打充分混匀主混合液，并短暂离心。
3. 在PCR管中加入适量（1 μL）的亚硫酸氢盐转化DNA至主混合液中。通过上下吹打混匀反应体系，并短暂离心。
4. 使用PEEK接头将一次性流体管路（内径0.25 mm，外径1.6 mm）连接至两个精密玻璃注射器（250 μL体积）。
5. 用含5%氟化表面活性剂的载油预先填充一个精密玻璃注射器，体积为250 μL。
6. 用50 µL载油预先填充另一个精密玻璃注射器，然后加载100 µL PCR混合液，以确保乳化过程中整个样品体积能够被完全分配。
7. 将液滴微流控装置安装在配备高速相机的直立光学显微镜载物台上，用于实时观察并记录液滴形成过程。
8. 将预填充的注射器安装到可编程注射泵上，并使用PEEK三通接头（见材料表），将注射器管路连接至液滴微流控装置各对应入口通道的管路。
9. 将液滴发生器出口端的管路插入0.5 mL PCR管中。
10. 调节注射泵流速至2 µL/min，在收集生成的乳化液之前，等待液滴大小稳定。
11. 收集乳化液，并将75 μL转移至0.2 mL PCR管中用于热循环。
12. 确保PCR管中的油相体积与分散相体积大致相等，以防止热循环过程中液滴发生融合。
13. 将0.2 mL PCR管放入热循环仪中，执行以下循环程序：95 °C预变性5 min，随后进行45个循环，每个循环包括95 °C变性15 s，60 °C退火/延伸30 s。

表1：引物和水解探针设计。

FOXP3 正向引物	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 反向引物	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z 正向引物	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z 反向	CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA
C-LESS 正向	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS 反向	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
FOXP3 探针	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
CDZ3 探针	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
C-Less 探针	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

表2：多重数字PCR的主混合液配方。

试剂	储存液	主混合液体积	工作浓度
Tris-HCl	1 M	2 µL	20 mM
KCl	1 M	10 µL	100 mM
MgCl2	25 mM	16 µL	4 mM
C-LESS 引物	10 µM	10 µL	每种 1 µM
CD3Z 引物	10 µM	10 µL	每种 1 µM
FOXP3 引物	10 µM	10 µL	每种 1 µM
C-LESS 探针	10 µM	5 µL	500 nM
CD3Z 探针	10 µM	5 µL	500 nM
FOXP3 探针	10 µM	5 µL	500 nM
HotStarTaq DNA 聚合酶	5 Units/µL	8 µL	0.4 Units/µL
亚硫酸氢盐处理的 DNA 模板	可变	可变	可变
无核酸酶水		可变
总体积		100 µL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PCR管	Bio-Rad，密西沙加，安大略省	TFI0201
氟化表面活性剂	RAN 生物技术公司，贝弗利，马萨诸塞州	008-FluoroSurfactant
一次性流体管路	多孔石	3200063
一次性流体管路	多孔石	3200302
PEEK接头	IDEX Health &华盛顿州奥克港科学与科学公司	P-881
载体油	3M，明尼苏达州圣保罗
直立式光学显微镜	尼康，纽约州梅尔维尔