基于管中芯片的数字PCR用于单核苷酸变异的定量分析

摘要

来源：Kahyo, T.，等。采用管中芯片形式对散发性家族性腺瘤性息肉病患者进行遗传变异的数字聚合酶链式反应检测。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了采用管中芯片形式的数字PCR在检测DNA样本中单核苷酸变异方面的应用价值。单个PCR反应被分配至多个反应腔室中，每个腔室相当于独立的PCR反应单元，通过检测目标扩增后在各腔室中产生的荧光信号，可计算出样本中变异等位基因的频率。

方案

1. 基因组DNA的质量控制

注意：采用成熟的基于硅胶膜的DNA纯化方法从外周血中提取基因组DNA（gDNA）。在进行以下操作步骤之前，使用分光光度计测定gDNA的浓度。

1. 将基因组DNA（gDNA）样品配制为浓度10-100 ng/µL。
2. 向8联管条中加入10 µL DNA样品缓冲液。
3. 向各管中加入1 µL DNA Marker或gDNA。使用微孔板附件涡旋振荡混合物1分钟。
4. 将管子、凝胶装置和移液器吸头装入电泳仪（材料表），然后按下“开始”按钮启动运行。
   注意：电泳系统在点击“开始”按钮后将自动运行。
5. 确认DNA样品缓冲液中的下部标记在电泳图谱中被正确识别。若识别错误，请在软件的“电泳图模式”中手动指定该标记。
   注意：DNA完整性数值（DIN）将自动计算。DIN值反映DNA的完整性，较高的DIN值表示gDNA完整性良好，较低的DIN值则表示gDNA严重降解。
6. 在软件的“区域模式”中指定gDNA的大小范围（> 200 bp），以自动计算该范围内gDNA（> 200 bp）的浓度。

2. 引物和探针设计

1. 计算熔解温度（T_m) 值，使用任何开放获取工具，需满足以下条件：10-25 个碱基，50 mM Na⁺/⁺，0.80 mM dNTPs 和 3 mM Mg²⁺ (材料清单）。设计扩增包含目标等位基因T的基因组区域的正向和反向引物_m 约60 °C的值，扩增子长度为100-300 bp。
   注意：参见 表1 用于寡核苷酸的浓度测定。
2. 根据以下条件设计针对参考等位基因和变异等位基因的锁核酸（LNA）探针：（i）每条探针包含1-6个LNA；（ii）每条探针的5'-末端和3'-末端分别标记荧光染料和淬灭基团；（iii）参考探针与变异探针之间的Tm值差异_m 匹配探针与不匹配探针的值之差 > 10 °C；（iv）T_m 匹配探针和错配探针的值分别高于和低于引物的值[例如，上游引物：60.8 °C，下游引物：59.8 °C，参考等位基因探针（匹配/不匹配）：62.6/45.3 °C，变异等位基因探针（匹配/不匹配）：61.7/50.5 °C］。T_m 数值使用与步骤 2.1 中相同的开放获取工具计算得出。
3. 确保设计的引物和探针不包含频率高于设定阈值的单核苷酸多态性 > 0.1%，根据数据库确定例如，单核苷酸多态性数据库（dbSNP）。

3. 数字PCR

1. 使用 TE 缓冲液配制引物、探针和基因组 DNA 储存液，浓度如表 1所述，并将其储存于 -20–4 °C。
2. 在室温下将试剂混合，总体积为 15 µL，终浓度如表 1 所述。
   1. 在无模板对照（NTC）中，用 3 µL 去离子水代替基因组 DNA。
   2. 为避免移液误差，按三份平行样准备 3.5 倍量的 PCR 混合液。
3. 上下吹打 PCR 混合液以充分混匀。
4. 将加样平台安装到 8 孔排管内置芯片上，并将其置于自动加样器中。确保芯片与加样平台之间接触良好。
5. 将加样滑块安装在平台上，并用手握住滑块，使止动器脱离加样器。
6. 在滑块尖端附近的平台上加入 15 µL PCR 混合液（图 1A）。
7. 按下加样器按钮运行加样程序（约 1 分钟）。
   注意：若平台上有少量 PCR 混合液残留并无影响，可依次重复运行加样器。
8. 将装有 PCR 混合液的芯片管放入密封增强仪的侧槽中。推动滑盖及顶盖边缘时注意不要损坏芯片（图 1B）。
9. 运行密封增强仪（约 2 分钟）。若仍可见液滴，则需再连续运行密封增强仪 1 分钟，以防止因密封不完全导致阳性信号交叉污染（图 1C 和 图 1D）。
10. 向各管中加入 230 µL 封闭液（一种油性试剂）。
    注意：此时芯片应完全浸没于液体中。
11. 将管子放入热循环仪中，按照表 2所述程序运行（约 2 小时）。若阳性分区分布不均，可调整 PCR 的温度或时间（图 1E）。
    注意：建议将升降温速率设置为约 1 °C/s。
12. 将管子留在热循环仪中至少 15 分钟，以降低基线噪声。
    注意：也可过夜放置，次日仍可检测到荧光信号。
13. 将管子置于检测夹具中，并向夹具内加入 6 mL 去离子水。若管内外可见气泡，请清除气泡（图 1F 和 图 1G）。
14. 将夹具装入检测仪，选择荧光、实验及样品/NTC 选项卡后，点击软件中的“运行”按钮开始检测（材料表）。
    注意：默认强度下，八个样品的双色检测耗时约 4–5 分钟。
15. 确认位置图、直方图和二维散点图。
    注意：若阴性分区的荧光强度过高，可点击软件中的“设置”按钮调整强度，使其落在 30–70 范围内。
16. 使用以下公式计算变异等位基因频率（VAF）：
    
    其中，Cv 和 Cr 分别为变异等位基因和参考等位基因的拷贝数。
    注意：软件程序将基于泊松统计自动计算上述数值。

4. PCR 产物的收集

1. 从离心管中移除封口液。
2. 向离心管中加入 100 µL TE 缓冲液，剧烈涡旋振荡 30 秒，然后短暂离心。
3. 将 TE 溶液转移至另一离心管，加入 30 µL 3 M 醋酸钠和 200 µL 乙醇。
4. 将溶液置于 -20 °C 冷却过夜。
5. 在 16,000 x g 条件下离心 30 分钟，弃去上清液。
6. 向离心管中加入 300 µL 80% 乙醇，涡旋振荡。
7. 在 16,000 x g 条件下离心 15 分钟，弃去上清液，将沉淀物在空气中干燥 5 分钟。
8. 干燥后，用 1–5 µL TE 缓冲液溶解沉淀物。
9. 如有必要，使用电泳仪参照步骤 1 检测产物大小。取 1 µL 溶液上样至凝胶装置以获得高灵敏度结果（材料表）。

结果

图1：芯片式管格式数字PCR检测中的注意事项。 （A）该图示展示如何在自动加样器中设置8管条。（B）该图示展示破损的芯片。（C）该图示展示芯片表面在（i）加样后和（ii）封膜后的状态；（iii）若封膜不完全，可见液滴残留。（D）该图示展示发生交叉污染时的位置分布图。（E）该图示展示分布不均时的位置分布图。（F）该图示展示管表面的气泡浸入水中的情况。（G）该图示展示管内部的气泡。在整个图中，黑色和白色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QIAamp DNA Blood Maxi试剂盒	Qiagen	51194	方案1前：基因组DNA提取
NanoDrop 1000	ThermoFisher SCIENTIFIC	ND-8000	方案1前：分光光度计
8联管	Agilent Technologies	401428	方案1
基因组DNA样品缓冲液	Agilent Technologies	5067-5366	方案1：
  	  	  	基因组DNA Screen Tape检测的组分
DNA标准品	Agilent Technologies	5067-5366	方案1：
  	  	  	基因组DNA Screen Tape检测的组分
MS3 Basic小型摇床	IKA	3617000	方案1：涡旋混合器
基因组DNA ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5365	方案1：凝胶装置
2200 TapeStation系统	Agilent Technologies	G2965AA	方案1：电泳仪器
TapeStation分析软件	Agilent Technologies	随G2965AA捆绑提供	方案1：分析软件
DNA寡核苷酸引物	IDT	定制订购	方案2
LNA探针	IDT	定制订购	方案2
软件工具	IDT	网站：http://biophysics.idtdna.com/	方案2
dbSNP数据库	NCBI	网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/	方案2
TE缓冲液	ThermoFisher SCIENTIFIC	12090015	方案3
无DNase/RNase蒸馏水	ThermoFisher SCIENTIFIC	10977015	方案3（表1）
Clarity Digital PCR探针预混液	JN Medsys	12013	方案3（表1）：2xPCR预混液
  	  	  	#10011的组分
Clarity封膜液	JN Medsys	12005	方案3：封膜液
  	  	  	#10011的组分
Clarity JN溶液	JN Medsys	12006	方案3（表1）：20x dPCR溶液
  	  	  	#10011的组分
Clarity管条	JN Medsys	12007	方案3：芯片管
  	  	  	#10011的组分
Clarity样品加载试剂盒	JN Medsys	12008	方案3：加载平台和滑片
  	  	  	#10011的组分
Clarity自动加载仪	JN Medsys	11002	方案3：自动加载仪
  	  	  	#10001的组分
Clarity封膜增强剂	JN Medsys	11003	方案3：封膜增强剂
  	  	  	#10001的组分
Clarity读取仪	JN Medsys	11004	方案3：读取仪
  	  	  	#10001的组分
Life Eco梯度PCR仪	Bioer Technology	TC-96GHbC	方案3：PCR仪
Clarity软件	JN Medsys	随#10001捆绑提供	方案3：分析软件
高灵敏度D1000检测胶带	Agilent Technologies	5067-5584	方案4：高灵敏度凝胶装置