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基于 Chip-in-a-Tube 的数字 PCR，用于定量单核苷酸变异

2025年7月8日

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源:Kahyo， T. 等人。数字聚合酶链反应测定使用 Chip-in-A 管格式对散发性家族性腺瘤性息肉病患者的遗传变异进行检测。J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频演示了 chip-in-a-tube 形式的数字 PCR 在检测 DNA 样品中单核苷酸变异的实用性。将单个 PCR 反应分配到充当独立 PCR 反应的腔室中，并检测来自腔室中扩增靶标的荧光信号来计算样品中变异等位基因的频率。

方案

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1. 基因组 DNA 的质量控制

注:使用成熟的基于二氧化硅膜的 DNA 纯化方法从外周血中提取基因组 DNA （gDNA）。在以下程序之前，使用分光光度计测定 gDNA 的浓度。

  1. 制备浓度为 10-100 ng/μL 的 gDNA 样品。
  2. 向 8 管联管中加入 10 μL DNA 样品缓冲液。
  3. 向试管中加入 1 μL DNA ladder 或 gDNA。使用微孔板附件涡旋混合物 1 分钟。
  4. 将试管、凝胶装置和移液器吸头装入电泳仪（材料表），然后按"开始"按钮开始运行><。 注意:电泳系统将通过单击"开始"按钮自动运行。
  5. 确认 DNA 样品缓冲液中包含的较低标记物在电泳图上被正确分配。如果分配错误，请在软件的"Electroherogram mode"中手动分配标记><。 注意:将自动计算 DNA 完整性值 （DIN）。DIN 值来自 DNA 完整性。高和低 DIN 值分别表示高度完整和高度降解的 gDNA。
  6. 在软件的"区域模式"中指定 gDNA 的大小区域 （> 200 bp） 以自动计算 gDNA 的浓度 （> 200 bp）。

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结果

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图 1:使用切入管形式的 dPCR 检测的注意事项。（A） 此面板显示了如何在自动加载器中设置 8 联管。（B） 此面板显示破损的芯片。（C） 该面板显示了 （i） 加载和 （ii） 密封后芯片的表面。（iii） 在密封不完全的情况下可以看到一滩液体。（D） 该面板显示了交叉污染情况下的位置图。（E） 此面板显示了分布不均匀情况下的位置图。（F） 该面板显示了管表面的气泡如何浸入水中。（G） 此面板显示管内的气泡。在整个图中，黑色和白色箭头分别表示破损的芯片和气泡。

表 1:用于 dPCR 检测的试剂。取决于预期的精度和灵.......

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材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 QIAamp DNA Blood Maxi 试剂盒 Qiagen（基亚根） 邮编 51194 方案 1 之前:基因组 DNA 的提取 纳米滴 1000 ThermoFisher 科学 ND-8000 型 方案 1 之前:分光光度计 8 联管 安捷伦科技公司 401428 协议 1 基因组 DNA 样品缓冲液 安捷伦科技公司 5067-5366 协议 1:          基因组 DNA 筛选 Tape Assay 的一个组成部分 DNA 分子量标准 安捷伦科技公司 5067-5366 协议 1:          基因组 DNA 筛选 Tape Assay 的一个组成部分 MS3 Basic 小型摇床 IKA 3617000 方案 1:涡旋混合器 基因组 DNA ScreenTape 安捷伦科技公司 5067-5365 方案 1:凝胶装置 2200 TapeStation 系统 安捷伦科技公司 G2965AA 方案 1:电泳仪 TapeStation 分析软件 安捷伦科技公司 与 G2965AA 捆绑在一起 方案 1:分析软件 DNA 寡核苷酸引物 IDT 定制订单 协议 2 LNA 探针 IDT 定制订单 协议 2 软件工具 IDT 网站: http://biophysics.idtdna.com/ 协议 2 dbSNP 数据库 NCBI 公司 网站: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ 协议 2 TE 缓冲液 ThermoFisher 科学 12090015 协议 3 不含 DNase/RNase 的蒸馏水 ThermoFisher 科学 10977015 协议 3（表 1） Clarity 数字 PCR 探针预混液 JN Medsys 公司 12013 年 方案 3（表 1）:2xPCR 预混液          #10011 的组件 Clarity 密封液 JN Medsys 公司 12005 年 方案 3:密封液          #10011 的组件 Clarity JN 解决方案 JN Medsys 公司 12006 年 方案 3（表 1）:20xdPCR 溶液          #10011 的组件 Clarity 联管 JN Medsys 公司 12007 年 方案 3:Chip-in-a-tube          #10011 的组件 Clarity 样品上样套件 JN Medsys 公司 12008 年 协议 3:加载平台和滑块          #10011 的组件 Clarity 自动加载程序 JN Medsys 公司 11002 元 协议 3:自动加载程序          #10001 的一个组件 Clarity Sealing Enhancer （透明度密封增强剂） JN Medsys 公司 11003 元 实验方案 3:密封增强剂          #10001 的一个组件 Clarity 阅读器 JN Medsys 公司 11004 元 协议 3:Reader          #10001 的一个组件 Life Eco 热循环仪 博日科技 TC-96GHbC 方案 3:热循环仪 Clarity 软件 JN Medsys 公司 与 #10001 捆绑销售 方案 3:分析软件 高灵敏度 D1000 丝网胶带 安捷伦科技公司 5067-5584 实验方案 4:高灵敏度凝胶装置

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