使用纳米流体芯片进行基于芯片的数字PCR检测稀有转录变体

摘要

来源：Molinari, C., 等. 通过芯片数字PCR检测新鲜冷冻胃癌组织中的CDH1稀有转录变体. J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了基于芯片的数字PCR——一种数字PCR技术的变体，可用于检测稀有转录本变异。PCR反应被分配到纳米流体芯片的各个反应室中，每个反应室均作为一个独立的反应单元。通过检测含有扩增靶标的反应室发出的荧光信号，即可确认样本中存在稀有转录本变异。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

注意： 本方案专为检测人新鲜冷冻组织中少量 cDNA 分子而设计。组织切片是在干冰上从先前已验证的患者来源的胃肿瘤或正常组织样本中冷冻切下的。

1. RNA 的提取与纯化

1. RNA 提取
   注意： RNA 分离在通风橱中使用特定产品进行（参见材料表）。然而，市面上有多种可用的分离试剂盒。
   1. 将 50 - 100 mg 新鲜冷冻并精细切割的组织样本置于 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL RNA 分离试剂，剧烈涡旋振荡 15 秒。将离心管在 -80 °C 下孵育过夜。
   2. 将含有样本的离心管在室温下孵育 5 分钟，并通过涡旋振荡 15 秒混匀。
   3. 将离心管置于冰上，加入 200 µL 氯仿，剧烈涡旋振荡 15 秒。
   4. 在室温下孵育离心管 60 秒，然后在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
   5. 将水相转移至另一 1.5 mL 离心管中，加入 20 µg 甘油原。
      注意： 为减少污染，需小心避免转移任何中间相或有机相。
   6. 加入 500 µL 异丙醇，反复倒置离心管以混匀，然后在冰上孵育 10 分钟。
   7. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟，使 RNA 沉淀。
      注意： RNA 将以凝胶状沉淀物形式附着在离心管壁和底部，离心后通常肉眼不可见。
   8. 小心移除上清液，不要扰动沉淀，用 1 mL 75% 乙醇通过移液进行洗涤。
   9. 在 4 °C 下以 7,500 x g 离心 5 分钟，移除上清液，不要扰动沉淀。
   10. 让沉淀干燥至透明，然后溶于 50 µL 无 RNase 水中。
   11. 在定量前，将样本在 -80 °C 下冷冻至少过夜。
2. 基因组 DNA 去除与 RNA 纯化
   注意： 为分析低丰度靶标，建议采用 DNase 消化步骤，随后进行基于柱的 RNA 纯化，以消化污染性 DNA。
   1. 使用注射器将冻干的 DNase I（1,500 Kunitz 单位）溶于 550 µL 无 RNase 水中，轻轻倒置小瓶混匀，并将重构后的储备液分装成若干等份。
   2. 在 1.5 mL 离心管中加入含 15 µg RNA 的计算体积样本、10 µL 试剂盒提供的 DNase 消化缓冲液（见材料表）、2.5 µL DNase I 储备液以及无 RNase 水，总体积补至 100 µL。在室温下孵育 10 分钟。
   3. 加入 350 µL 组织裂解缓冲液（来自试剂盒，参见材料表），通过移液混匀。
   4. 加入 250 µL 100% 乙醇，通过移液混匀。
   5. 将全部体积（700 µL）转移至新的离心柱中，在 12,000 x g 下离心 15 秒。
   6. 将滤柱转移至新的收集管中，向柱中加入 500 µL 80% 乙醇，在 12,000 x g 下离心 2 分钟。
   7. 打开离心柱盖，在 12,000 x g 下用新的收集管离心 5 分钟以干燥滤膜，然后将滤柱转移至 1.5 mL 离心管中。
   8. 直接向滤柱中加入 14 µL 无 RNase 水，在 12,000 x g 下离心 1 分钟。
   9. 将样本置于冰上，取 2 µL 样本使用台式分光光度计进行定量，或在 -80 °C 下保存 RNA 以备后续使用。

2. 数字PCR反应体系的建立

1. dPCR 反应体系配制与样品准备
   1. 将预混液和探针在室温下解冻至少 20 分钟。
   2. 将 cDNA 样品稀释至 6 µL 水中，终浓度为 300 ng。
   3. 轻轻涡旋混匀预混液，并在无菌离心管中配制反应体系：加入 8.7 µL 预混液、0.87 µL 针对 CDH1a 基因设计的定制探针引物和 1.83 µL 无核酸酶水，总体积为 11.4 µL。
      注意：有关 CDH1a 定制探针引物的详细信息，请参见材料表。
   4. 将 11.4 µL 配制好的反应体系转移至稀释后的 cDNA 样品中，轻轻混匀后短暂离心。
      注意：所列体积已包含 20% 的过量，以补偿移液过程中的损耗。应为所有样品及无模板对照（NTC）配制反应体系。
2. 芯片准备
   注意：为获得最佳结果，建议配制后尽快上样至芯片。
   1. 接通芯片加载仪电源，等待指示灯变为绿色。
   2. 轻轻回拉浸润液注射器活塞 1–2 mm 后松开，以方便取下注射器帽，随后更换为新的吸头。
   3. 取一枚新芯片，记录芯片盖上的编码，以便与样品对应。
   4. 小心握住芯片盖边缘，剥离保护膜，并将粘性面向上按正确方向放置。
   5. 小心拿起芯片，避免接触内部区域，通过下压杠杆打开夹具，将芯片准确放入芯片托座中。
   6. 将新的上样刀片安装至加载仪上，并轻推以确保其牢固就位。
   7. 将 14.5 µL dPCR 反应体系转移至加载刀片上，避免产生气泡或使刀片弯曲，随后按下黑色上样按钮，使液体均匀分布于芯片上。
   8. 使用浸润液注射器向芯片表面滴加约 20 滴液体，注意吸头勿接触芯片表面。
      注意：必须完全覆盖整个表面，同时避免液体溢出边缘。
   9. 旋转加载臂，使芯片盖与芯片接触，并压下保持 15 秒。
   10. 按下芯片盖释放按钮，松开芯片，并将加载臂复位。
   11. 将组装好的芯片倾斜 45°，通过注液口用注射器小心加入浸润液，轻微旋转芯片以确保无气泡残留，并用无菌擦拭纸去除多余液体。
   12. 轻轻撕去芯片盖顶部的标签，将密封贴片覆盖注液口并按压至少 5 秒，完成密封。
   13. 将芯片避光保存，待热循环仪使用。
       注意：制备好的芯片应在 2 小时内使用。
3. dPCR 反应
   1. 打开热循环仪盖，为两个温控模块均安装适配器，即使仅使用一个模块也需如此。
   2. 将芯片按正确位置放置于样品模块上。
      注意：注液口应朝向热循环仪前方，并处于抬高位置，以便任何气泡上浮至顶部而不影响芯片观察窗区域。使用空芯片平衡两个模块。
   3. 将导热垫覆盖在样品模块上，完全覆盖所有芯片。
   4. 关闭盖子并启动 PCR 程序，设置如下条件：96 °C 预变性 10 分钟；45 个循环（60 °C 延伸 2 分钟，98 °C 变性 30 秒）；60 °C 延伸 2 分钟；4 °C 保存。程序结束后关闭热循环仪，将芯片在室温下静置解冻至少 10 分钟。
      注意：芯片分析必须在 1 小时内完成。
4. 芯片分析
   1. 打开仪器盖，取下导热垫，然后从适配器中取出芯片。
      注意：在分析前，将芯片存放于避光、洁净的环境中。
   2. 使用异丙醇和无菌擦拭纸清洁芯片表面。
      注意：检查每枚芯片是否存在泄漏或其他潜在问题。
   3. 将 USB 插入检测系统以保存数据。
   4. 打开检测系统的芯片托盘，将芯片正面朝上按正确位置放入，然后关闭托盘。
   5. 等待 30 秒进行处理，随后取出芯片并插入下一张。
   6. 待所有芯片分析完成后，将 USB 插入计算机以传输数据文件。
      注意：每张芯片的分析总时间约为 2 至 3 分钟。

3. 数据分析与解释

1. 连接到基于云的软件平台，以进行所有下游分析。
2. 创建项目并导入所有目标芯片的数据文件。
3. 输入样本名称；在“Define Chips”选项卡中选择所用的染料和检测方法。
4. 在“Review Data”选项卡中可视化芯片图像，检查样本在芯片上的加载完整性以及可评估的数据点数量，以判断芯片是否合格。
   注意：可评估数据点少于13,000的芯片应予以剔除。
5. 转至屏幕右侧所选芯片的散点图；对所有芯片的荧光素酰胺（FAM）报告染料信号（Y轴）设置6,000的阈值。
   注意：阈值设置可能根据所用检测方法的不同而有所调整。
6. 使用套索工具在散点图上选中可疑的阳性信号，并点击“undetermined”将其移除，以避免假阳性结果。所有剩余的阳性信号点表明存在所分析稀有靶标的cDNA拷贝。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TRIazol 试剂	Thermo Fisher Scientific	15596018
糖原 20 mg/ml	ROCHE	10901393001
RNeasy MinElute 纯化试剂盒	QIAGEN	74204
iScript cDNA 合成试剂盒	BioRad	1708891
QuantStudio 3D 数字 PCR 主混合液 v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
CDH1a IDT 定制设计检测	Integrated DNA Technologies (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR 优化检测浓度：900 nM (F)，900 nM (R)，250 nM (P)]
QuantStudio 3D 数字 PCR 20K 芯片试剂盒 v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Heraeus Biofuge Fresco	Thermo Scientific	75002402
热循环仪（Labcycler）	Sensocquest	011-103
GeneAmp PCR 系统 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
双平块样品模块	Thermo Fisher Scientific	4425757
用于双平块 GeneAmp PCR 系统 9700 的 QuantStudio 3D 倾斜底座	Thermo Fisher Scientific	4486414
用于平块热循环仪的 QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片适配器套件	Thermo Fisher Scientific	4485513
QuantStudio 3D 数字 PCR 芯片加载器	Thermo Fisher Scientific	4482592
带电源线的 QuantStudio 3D 数字 PCR 仪器	Thermo Fisher Scientific	4489084