基于芯片的数字 PCR 使用纳米流控芯片检测罕见的转录本变体

Abstract

来源:Molinari， C. 等人。通过基于芯片的数字 PCR 检测新鲜冷冻胃癌组织中的 CDH1 罕见转录本变体。 J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频演示了基于芯片的数字 PCR，这是数字 PCR 技术的一种变体，可用于检测罕见的转录本变体。PCR 反应被分配到纳米流体芯片的腔室中，每个腔室都充当一个独立的反应。从具有扩增靶标的腔室中检测到的荧光信号证实了样品中存在罕见的转录本变体。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

注:该程序专为检测人新鲜冷冻组织中少量 cDNA 分子而设计。组织切片是在干冰上从先前验证的患者来源的胃肿瘤或正常组织样本中冷冻的。

1. RNA 分离和纯化

1. RNA 提取
   注意:使用特定产品在引擎盖下进行 RNA 分离（参见材料表）。但是，市面上有各种隔离试剂盒。
   1. 将 50 - 100 mg 精细切割的新鲜冷冻组织样品用 1 mL RNA 分离试剂在 1.5 mL 试管中匀浆，并剧烈涡旋 15 秒。将试管在 -80 °C 下孵育过夜。
   2. 将含有样品的试管在室温下孵育 5 分钟，然后涡旋混合 15 秒。
   3. 将试管放在冰上，加入 200 μL 氯仿，并剧烈涡旋 15 秒。
   4. 将试管在室温下孵育 60 秒，并在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
   5. 将水相转移到 1.5 mL 试管中，加入 20 μg 糖原。
      注意:重要的是要小心避免转移任何界面层或有机层，以减少污....

Materials