基于芯片的数字 PCR 使用纳米流控芯片检测罕见的转录本变体

Abstract

来源:Molinari， C. 等人。通过基于芯片的数字 PCR 检测新鲜冷冻胃癌组织中的 CDH1 罕见转录本变体。 J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频演示了基于芯片的数字 PCR，这是数字 PCR 技术的一种变体，可用于检测罕见的转录本变体。PCR 反应被分配到纳米流体芯片的腔室中，每个腔室都充当一个独立的反应。从具有扩增靶标的腔室中检测到的荧光信号证实了样品中存在罕见的转录本变体。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

注:该程序专为检测人新鲜冷冻组织中少量 cDNA 分子而设计。组织切片是在干冰上从先前验证的患者来源的胃肿瘤或正常组织样本中冷冻的。

1. RNA 分离和纯化

1. RNA 提取
   注意:使用特定产品在引擎盖下进行 RNA 分离（参见材料表）。但是，市面上有各种隔离试剂盒。
   1. 将 50 - 100 mg 精细切割的新鲜冷冻组织样品用 1 mL RNA 分离试剂在 1.5 mL 试管中匀浆，并剧烈涡旋 15 秒。将试管在 -80 °C 下孵育过夜。
   2. 将含有样品的试管在室温下孵育 5 分钟，然后涡旋混合 15 秒。
   3. 将试管放在冰上，加入 200 μL 氯仿，并剧烈涡旋 15 秒。
   4. 将试管在室温下孵育 60 秒，并在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
   5. 将水相转移到 1.5 mL 试管中，加入 20 μg 糖原。
      注意:重要的是要小心避免转移任何界面层或有机层，以减少污染。
   6. 加入 500 μL 异丙醇，倒置试管混合，并在冰上孵育 10 分钟。
   7. 将试管在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟以沉淀 RNA。
      注意:RNA 将存在于试管侧面和底部的凝胶状沉淀中，离心后通常不可见。
   8. 在不干扰沉淀物的情况下去除上清液，并通过移液用 1 mL 75% 乙醇洗涤。
   将
   9. 试管在 4 °C 下以 7,500 x g 离心 5 分钟，并在不干扰沉淀的情况下去除上清液。
   10. 让沉淀物干燥，直到沉淀物变得透明，然后将其溶解在 50 μL 不含 RNase 的水中。
   11. 定量前将样品在 -80 °C 下冷冻至少过夜。
2. 基因组 DNA 去除和 RNA 纯化
   注意:建议对低丰度靶标进行 DNase 消化步骤，然后进行基于柱的 RNA 纯化，以消化污染的 DNA。
   1. 使用注射器将冻干的 DNase I（1,500 Kunitz 单位）溶解在 550 μL 不含 RNase 的水中，倒置小瓶轻轻混合，然后将复溶的储备液分成等分试样。
   2. 将计算体积的样品加入 1.5 mL 试管中，加入 15 μg RNA、试剂盒中的 10 μL DNase 消化缓冲液（列于材料表）、2.5 μL DNase I 储备液和不含 RNase 的水，加入 100 μL。在室温下孵育 10 分钟。
   3. 加入 350 μL 组织裂解缓冲液（来自试剂盒，参见材料表）并通过移液混合。
   4. 加入 250 μL 100% 乙醇并通过移液混合。
   5. 将整个体积 （700 μL） 转移到新的离心柱中，并以 12,000 x g 离心 15 秒。
   6. 将过滤器转移到新的收集管中，向色谱柱中加入 500 μL 80% 乙醇，并以 12,000 x g 离心 2 分钟。
   7. 打开离心柱的盖子，用新的收集管以 12,000 x g 离心 5 分钟以干燥过滤器;然后将过滤器转移到 1.5 mL 管中。
   8. 将 14 μL 不含 RNase 的水直接加入过滤柱中，并以 12,000 x g 离心 1 分钟。
   9. 将样品保存在冰上，并在台式分光光度计上使用 2 μL 样品进行定量，或将 RNA 储存在 -80 °C 直至使用。

2. 数字 PCR 反应体系构建

1. dPCR 反应混合物和样品制备
   1. 在室温下解冻预混液和测定至少 20 分钟。
   2. 用 6 μL 水将 cDNA 样品稀释至 300 ng 浓度。
   3. 轻轻涡旋预混液，并在无菌管中加入 8.7 μL 预混液、0.87 μL CDH1a 定制设计的测定引物和 1.83 μL 无核酸酶水，最终体积为 11.4 μL。
      注意:有关 CDH1a 定制设计的检测引物详细信息，请参见材料表。
   4. 将 11.4 μL 制备的混合物转移到稀释的 cDNA 样品中，轻轻混匀，然后短暂离心><。 注意: 体积包括 20% 的过量部分，以补偿移液造成的体积损失。为所有样品和无模板对照 （NTC） 准备混合物。
2. 筹码准备
   注意:为获得最佳效果，请尽快装入芯片。
   1. 插入芯片加载器并等待指示灯变为绿色。
   2. 轻轻将柱塞向后拉 1 - 2 毫米并松开，以方便此步骤，然后更换喷嘴，以取下浸入液注射器的盖子。
   3. 取一个新的芯片，记下盖子上写的代码，以将其与样品相关联。
   4. 小心地握住盖子的侧面，撕下保护膜，然后将粘性面朝上按正确的方向放置盖子。
   5. 小心地拾取芯片，注意不要触摸内部部件，然后按下控制杆打开夹具，将其加载到芯片巢的正确位置。
   6. 将新的装载刀片装载到装载机上并轻轻推动以确保其牢固就位。
   7. 将 14.5 μL dPCR 反应混合物转移到加载刀片上，而不会产生气泡或使刀片偏转，然后按下黑色加载按钮以分配芯片上的体积。
   8. 使用浸入液注射器将大约 20 滴液滴到芯片表面，注意不要用尖端接触表面。
      注意:重要的是要覆盖整个表面，而不会将液体溢出到边缘。
   9. 旋转装载机臂，使盖子与芯片接触，然后按下 15 秒。
   10. 按下盖子按钮以释放芯片并将臂放回原位。
   11. 将组装好的芯片保持 45° 角，用注射器小心地通过填充口分配浸入液，稍微旋转芯片以确保没有气泡，然后用无菌擦拭擦去多余的液体。
   12. 轻轻撕下芯片盖顶部的标签，然后按压填充口至少 5 秒，以密封芯片盒。
   13. 将芯片避光存放，直到准备好加载到热循环仪中。
       注意:准备好的薯片应在 2 小时内使用。
3. dPCR 反应
   1. 打开盖子，将适配器安装到两个块上，即使使用单个块也是如此。
   2. 将芯片放在样品块上的正确位置。
      注意: 填充口必须朝向热循环仪的前部，处于升高的位置，以允许任何气泡漂浮到顶部，而不会干扰芯片的窗口。使用空筹码来平衡两个块。
   3. 将导热垫放在样品块上，以完全覆盖芯片。
   4. 盖上盖子并开始 PCR 运行，应用以下条件:在 96 °C 下保持 10 分钟;60 °C 2 分钟和 98 °C 45 次循环 30 秒;在 60 °C 下保持 2 分钟;在 4 °C 下保持。关闭热循环仪并在室温下解冻芯片至少 10 分钟><。 注意:芯片分析必须在 1 小时内完成。
4. 芯片分析
   1. 打开仪器盖，取下导热垫，然后从适配器中取出芯片。
      注意:将芯片存放在避光、干净的地方，直到分析。
   2. 用异丙醇和无菌湿巾清洁芯片表面。
      注意:检查每个芯片是否有泄漏或潜在问题。
   3. 将 USB 插入检测器系统以保存数据。
   4. 打开检测器系统的芯片托盘，将芯片正面朝上加载到正确的位置，然后关闭托盘。
   5. 等待 30 秒进行处理，然后取出芯片并插入下一个芯片。
   6. 等待所有加工过的芯片的分析完成，然后将 USB 插入计算机以传输文件。
      注意:分析总时间约为 2 至 3 分钟/芯片。

3. 数据分析与解释

1. 连接到执行所有下游分析所需的基于云的软件平台。
2. 创建一个项目并导入感兴趣的芯片的所有数据文件。
3. 输入样品名称;选择"Define Chlips"（定义芯片）选项卡中使用的染料和检测方法。
4. 通过在"Review Data"（查看数据）选项卡中可视化芯片，检查样品加载到芯片上的彻底程度以及可评估的数据点数量，确定芯片是否可接受。
   注意: 剔除可评估数据点少于 13,000 个的芯片。
5. 移动到屏幕右侧所选芯片的散点图;将荧光素酰胺 （FAM） 报告基因染料信号（Y 轴）的阈值 6,000 应用于所有芯片。
   注意:阈值设置可能因所使用的分析而异。
6. 通过使用套索工具选择散点图上的相对点并按"未确定"，删除任何可疑的阳性信号以防止假阳性结果。所有剩余的阳性点表明存在所分析的稀有靶标的 cDNA 拷贝。

Materials