点印迹法检测病毒基因组定量

摘要

来源：Powers, J. M. 等., 一种用于腺相关病毒滴定的定量点印迹检测方法及其在腺相关病毒组装激活蛋白功能评估中的应用 J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们介绍了用于定量病毒基因组的点印迹法。信号强度与样品中病毒DNA的含量直接相关。

方案

注意：本实验方案所需的溶液和缓冲液配方见 表1。

1. 点印迹

1. 质粒DNA标准品的制备
   1. 将AAV载体基因组质粒DNA用去离子水或Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 8.0）稀释至10 ng/µL。取25 µL该稀释液，在50 µL反应体系中加入适当的限制性内切酶，37°C消化1小时以线性化质粒DNA。
      注意：我们同时制备两份消化反应（见步骤1.4.1）。所选酶切位点应位于点杂交探针结合区域之外。为方便起见，可将稀释后的质粒DNA分装（25 µL/管），于-20 °C保存以备后续使用。可在步骤5.1振荡过程中进行质粒DNA的酶切。切勿对质粒DNA标准品过度消化。
   2. 向含有已消化质粒DNA标准品的离心管中加入450 µL去离子水或TE缓冲液，并充分混匀。取70 µL该混合液转移至新的1.5 mL微量离心管中，加入1,330 µL去离子水或TE缓冲液，配制成稀释的质粒标准品（25 pg/µL）。
   3. 根据 表1 进行两倍系列稀释（每管600 µL），并通过涡旋振荡5秒充分混匀各稀释液。
2. 标准品与病毒DNA样品的变性处理
   1. 向每份标准品稀释液中加入600 µL 2x碱性溶液，涡旋振荡5至10秒以充分混匀，室温孵育10分钟。
   2. 向每个病毒DNA样品中加入120 µL 2x碱性溶液，涡旋振荡5至10秒以充分混匀，室温孵育10分钟。
3. 点杂交装置的组装
   1. 使用剪刀将印迹膜（例如，zeta-probe膜）裁剪为适合样品和标准品数量的尺寸，并用去离子水浸泡10分钟，然后将其放置于点杂交装置上。用保护片覆盖装置上未使用的孔位。
      注意：请使用洁净镊子操作膜。可使用随膜提供的浅蓝色保护片覆盖空孔。在加样前切勿让膜干燥。有关装置组装和使用的更多细节，请参阅用户手册。
   2. 向将要加样的孔中加入去离子水。施加真空，使水通过各孔以检查是否存在漏液，若发现问题修复后需重新测试。在抽真空的同时重新拧紧螺丝，确保密封严密。
      注意：密封不完全可能导致样品在孔间泄漏。
   3. 待水完全抽干后，完全释放真空（即，真空歧管应与大气压相通）。
4. 向点杂交装置中加载标准品和样品
   1. 向每个孔中加入400 µL稀释后的质粒DNA标准品，共运行四组标准品稀释梯度。使用两份独立的酶切产物标准品，并分别进行双复孔加样。每个病毒DNA样品每孔加样200 µL。
      注意：若有必要，可利用剩余约40 µL的变性样品制备进一步稀释的样品（例如，取20 µL样品加入180 µL 1x碱性溶液，制成10倍稀释样品），并进行点样。
   2. 施加轻柔真空，使DNA溶液通过孔膜。
      注意：需通过部分打开三通阀调节真空压力，使真空同时作用于点杂交装置和大气（即，旋塞臂呈约45°角，此时可听到较响的吸气声）。
   3. 待所有孔完全排空后，通过调节三通阀释放真空。向曾加有标准品和样品的每个孔中加入400 µL 1x碱性溶液。等待5分钟后重新施加真空以排空各孔。
   4. 以相同方式再次施加真空。
   5. 在真空状态下拆卸点杂交装置，取出膜并用2x SSC缓冲液冲洗。将膜放置于洁净的纸巾上，DNA结合面朝上，以去除多余的2x SSC。
   6. 使用适当的紫外交联仪将点杂交后的DNA固定于膜上；此时膜即可用于杂交。
      注意：湿润的膜可直接用于紫外交联。干燥后的紫外交联膜可在室温下保存。更多相关信息见 材料表。

2. 杂交与洗涤

1. 在65 °C水浴中预热杂交缓冲液。
2. 使用放射性 α- 核苷酸对 DNA 探针进行酶促标记³²使用市售试剂盒，按照生产商推荐的方法纯化P dCTP。
   注意： 我们使用长度为0.5–2.0 kb的探针，来源于病毒基因组中的增强子-启动子区域或蛋白质编码序列。尽管本方案采用 ³²P标记的放射性探针用于信号检测，也可使用非放射性的化学发光或荧光探针（请参见 讨论 部分）
3. 将膜放入杂交瓶中，DNA结合面朝上，用5 mL预热的杂交缓冲液冲洗膜后弃去缓冲液。随后加入10 mL预热的杂交缓冲液，将杂交瓶置于65 °C的旋转杂交炉中，旋转孵育不少于5分钟。
4. 将20 µL浓度为10 mg/mL的剪切鲱鱼或鲑鱼精子DNA溶液加热变性 ³²P标记的探针（≥10⁷ 在100 °C的加热块上放置离心管，5分钟内达到cpm，然后在冰上快速冷却至少2分钟，短暂离心，并在使用前保持在冰上。
   注意： 对于放射性DNA探针，必须使用带螺口盖和O型圈的1.5 mL离心管。
5. 将变性的精子DNA和放射性探针迅速加入杂交瓶中的杂交缓冲液内，振荡混匀10秒。将杂交瓶放回65 °C烘箱，于65 °C旋转孵育不少于4小时。
6. 杂交完成后，停止旋转，取出杂交瓶，将放射性探针溶液倒入带有防漏封口盖的50 mL锥形管中。将探针储存于适当的容器内，并置于指定存放放射性物质的冰箱中。
   注意： 使用后含有探针且探针储存于 4 °C 的杂交缓冲液，可通过将装有该缓冲液并配有防漏密封盖的 50 mL 锥形管置于 100 °C 水浴中加热 5 分钟，至少重复使用 5 次。
7. 用预热至 65 °C 的洗涤缓冲液洗涤膜。向杂交瓶中加入 20 至 30 mL 洗涤缓冲液，旋转孵育 5 分钟。重复此洗涤步骤 2 次。
   注意： 根据当地机构的要求，测量洗涤液的放射性并记录结果。
8. 洗涤膜的同时，将磷光成像屏置于成像擦除仪上5分钟。
9. 第三次洗涤后，将膜从杂交瓶中取出，用纸巾吸去膜表面多余的缓冲液，然后将膜放入透明的塑料胶片保护袋中。使用盖革计数器检测膜上的放射性信号。根据信号强度，将已擦除的磷屏成像板暴露于膜上10分钟至过夜。
10. 使用磷屏成像系统扫描膜，并获取每个点信号强度的数据。

表1：定量点印迹质粒DNA标准品。 显示了通过两倍系列稀释法配制质粒DNA标准品所需的25 pg/µL质粒DNA标准溶液以及水或TE的体积（每管600 µL）。质粒DNA标准品列中的数值（0.039至5 ng）表示每种质粒DNA标准溶液200 µL中的DNA含量。

质粒DNA标准品（ng）	25 pg/µL 质粒DNA 标准溶液的体积（µL）	水的体积（µL）	总体积（µL）
5	600	0	600
2.5	300	300	600
1.25	150	450	600
0.625	75	525	600
0.313	37.5	562.5	600
0.156	18.8	581.2	600
0.078	9.4	590.6	600
0.039	4.7	595.3	600

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苯并核酸酶	MilliporeSigma	1016970001	在正文中的名称为 Serratia marcescen 内切核酸酶 。
DNase I	Roche	4716728001	在正文中的名称为 DNase I 酶 A。
DNase I	Invitrogen	18047019	在正文中的名称为 DNase I 酶 B。
DNase I	New England Biolabs	M0303L	在正文中的名称为 DNase I 酶 C。
1.5 mL 带O型圈螺口离心管	Corning	430909
15 mL 聚丙烯锥形管	Corning	352097
3 M 乙酸钠	Teknova	S0298
50 mL 聚丙烯锥形管	Corning	430291
AccuGENE 0.5 M EDTA 溶液	Lonza	51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0	Lonza	51238
AccuGENE 10% SDS	Lonza	51213
AccuGENE 1X TE 缓冲液	Lonza	51235
Bio-Dot 装置	Bio-Rad	1706545
牛血清白蛋白	MilliporeSigma	A3294
细胞刮铲	Corning	3008
氯仿	MilliporeSigma	372978
DNA 提取试剂盒	Wako Pure Chemical Industries	295-50201	用于纯化病毒的定量点杂交实验。我们仅使用制造商提供的说明书方案2中每一步推荐试剂体积的一半。
200 无水乙醇	Decon Labs	2716
Ficoll 400	Alfa Aesar	B22095	在文中称为多聚蔗糖 400。
糖原	Roche	10901393001
鲱鱼精子 DNA	Invitrogen	15634-017
杂交管	Thermo Fisher Scientific	13-247-150
ImageQuant TL	GE Healthcare Life Sciences	ImageQuant TL
六水合氯化镁	MilliporeSigma	M0250
磷屏成像曝光盒	GE Healthcare Life Sciences	Various
磷屏成像屏	GE Healthcare Life Sciences	Various
质粒大提试剂盒	QIAGEN	12162
聚乙烯亚胺	Polysciences Inc	23966-2
聚乙烯吡咯烷酮	MilliporeSigma	P5288
蛋白酶 K 溶液	Invitrogen	25530-049
限制性内切酶	New England Biolabs	Various
鲑鱼精子 DNA	Invitrogen	15632011
血清移液管	Thermo Fisher Scientific	13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
氯化钠	Thermo Fisher Scientific	S271-10
二水合柠檬酸三钠	MilliporeSigma	C8532
Tris 碱	Thermo Fisher Scientific	BP152-5
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28955809
UltraPure 缓冲饱和酚	Invitrogen	15513-047
紫外交联仪	Spectroline	XLE-1000	使用最佳交联模式，提供 120 mJ/cm² 的紫外能量剂量。
Zeta-Probe 膜	Bio-Rad	162-0165